低热高压法制作PLGA支架的三维结构研究

目的制作不含有机溶剂、三维结构良好的聚丙交酯-乙交酯共聚物（PLGA）支架,使之符合组织工程骨修复的需要,探讨一种新型聚合物支架制作方法。方法将聚合物与氯化钠粉碎后,采用低热高压法制作PLGA泡沫结构支架,经密度法、氯化钠法测定其空隙率、开孔率;扫描电镜观察表面和内部结构、测定孔径。结果利用此种方法制作的PLGA支架,空隙率达到90.0％和92.5％、孔径在200-250μm之间、开孔率为98.0％以上（P<0.01）,平均氯化钠沥净时间为12～13h。结论使用低热高压法制作的组织工程支架,三维结构稳定,各项参数可控制;根据模具的大小可以制作不同体积的支架;依据盐的颗粒粒度与数量控制支架的孔径和空隙率,在制作过程中不使用有机溶剂,减少了有机溶剂残留可能引起的对细胞的毒性。使用这种方法要对聚合物与氯化钠颗粒进行充分混合。

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。

平面和三维培养对兔髓核细胞增殖和基质合成影响的实验研究

目的:探讨兔髓核细胞平面和三维培养对其增殖及基质合成的影响,为椎间盘组织工程寻找一种新的种子细胞获取方法。方法:体外培养兔髓核细胞,分为平面培养组和PLGA支架三维培养组两组,利用倒置显微镜、扫描电镜进行髓核细胞形态学观察,MTT法测定各组髓核细胞增殖情况,HE染色、免疫组化分析髓核细胞Ⅱ型胶原的表达,阿利新兰染色法测定培养液中髓核细胞合成的糖胺聚糖(GAG)含量。结果:经过两周的培养,两组髓核细胞均能够增殖;与平面培养组相比,三维培养组细胞增殖率、Ⅱ型胶原表达量、GAG合成量均增高(均P<0.01)。结论:髓核细胞能够与PLGA支架很好地黏附并增殖;PLGA支架三维培养较平面培养能促进髓核细胞增殖,提高Ⅱ型胶原和GAG的合成量,可作为椎间盘组织工程种子细胞获取的一种新方法。

乳鼠心肌细胞的体外三维培养

【目的】探讨应用PLGA泡沫支架材料,在体外建造组织工程化心肌组织的可行性。【方法】采用顺序消化及差速贴壁法分离纯化乳鼠心肌细胞,将分离所得的心肌细胞接种于PLGA多孔支架材料上,观测复合体内心肌细胞的生长状况、超微结构、细胞代谢率及细胞组分的变化,并将其与正常心肌和二维培养的心肌细胞进行比较。【结果】复合体内的细胞具有心肌细胞的特殊超微结构,免疫组化显示其中的α-横纹肌肌动蛋白染色呈强阳性,与二维培养的细胞相比,细胞代谢更加旺盛。【结论】采用组织工程技术有可能在体外培育出组织工程化心肌组织。

PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架材料的制备及细胞相容性研究

目的探讨PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架的制备方法及细胞相容性。方法采用静电纺丝法制备PLGA-丝素-胶原(实验组)及单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架,扫描电镜观察两组支架材料,测定支架纤维直径、孔隙率、吸水率及抗拉强度。取8只SD近交系乳鼠双侧臂丛神经及坐骨神经,分离培养SC,S-100免疫组织学观察并测定SC纯度。取第4代SC以5×104个/mL分别与25%、50%及100%浓度的两组支架浸提液进行培养,以DMEM培养作空白对照组。培养1、3、5、7d采用MTT法测定吸光度(A)值。将第4代SC以5×104个/mL密度分别接种至PLGA-丝素-胶原(实验组)和单纯PLGA(对照组)纳米三维多孔支架支架复合培养。复合培养2、4、6d行扫描电镜观察,另于4d行激光扫描共聚焦显微镜观察SC在材料上生长情况。结果扫描电镜观察显示两组支架呈相互交联的多孔网状无纺结构。实验组和对照组纤维直径分别为(141±9)nm和(205±11)nm;支架内孔洞相互连通,孔隙率分别为87.4%±1.1%和85.3%±1.3%;吸水率分别为2647%±172%和2593%±161%;抗拉强度分别为(0.32±0.03)MPa和(0.28±0.04)MPa;两组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。S-100免疫组织化学染色显示SC纯度为96.5%±1.3%。MTT检测SC在不同浓度实验组及空白对照组中生长良好,A值均随时间延长而增大,同组各时间点比较,差异均有统计学意义(P<0.05);各时间点各浓度实验组及空白对照组间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。扫描电镜观察显示,实验组SC在支架上生长良好,4d轴突连接,6d后大量增殖,基质分泌;生长情况优于对照组。复合培养4d激光扫描共聚焦显微镜观察结果与扫描电镜一致。结论采用静电纺丝方法制备的PLGA-丝素-胶原纳米三维多孔支架安全无毒,具备合适的孔径和孔隙率,适合SC生长,细胞相容性良好,是一种组织工程神经良好的支架载体。