系统性硬化症合并肺间质病变患者外周血单个核细胞全基因组DNA甲基化和转录组表达谱

目的:分析系统性硬化症(systemic sclerosis,SSc)合并肺间质病变(interstitial lung disease,ILD)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)全基因组DNA甲基化和转录组表达谱,并进一步探讨DNA甲基化对Wnt/β-catenin信号通路和趋化因子信号通路的影响。方法:收集19例SSc患者(SSc组)及18例健康人(对照组)外周血PBMCs。SSc患者中有10例合并ILD(SSc合并ILD亚组)、9例未合并ILD(SSc未合并ILD亚组)。采用Illumina 450K甲基化芯片和Illumina HT-12 v4.0基因表达谱芯片分析全基因组DNA甲基化和基因表达水平,研究DNA甲基化对Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路的影响。结果:全基因组DNA甲基化分析发现:与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组存在71个高甲基化位点,98个低甲基化位点。转录组分析发现:与SSc未合并ILD亚组相比,SSc合并ILD亚组有164个基因表达上调,191个基因表达下调。SSc组患者PBMCs中Wnt/β-catenin信号通路中有35个低甲基化基因,其中卷曲同源物1(frizzled-1,FZD1)、丝裂原活化蛋白激酶9(mitogen-activated protein kinase 9,MAPK9)、母亲DPP同源物2(mothers against DPP homolog 2,SMAD2)、转录因子7类似物2(transcription factor 7-like 2,TCF7L2)和无翅型MMTV整合位点家族成员5B(wingless-type MMTV integration site family,member 5B,WNT5B)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中Dickkopf相关蛋白2(dickkopf homolog 2,DKK2)、FZD1、MAPK9等多个基因的mRNA表达虽上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。趋化因子信号通路中有38个低甲基化基因,其中β-抑制蛋白1(β-arrestin 1,ARRB1)、C-X-C基序趋化因子配体10(C-X-C motif chemokine ligand 10,CXCL10)、C-X-C基序趋化因子配体16(C-XC motif chemokine ligand 16,CXCL16)、FGR、中性粒细胞胞浆因子1C(neutrophil cytosolic factor 1C,NCF1C)mRNA在SSc组中的表达显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与SSc未合并ILD亚组比较,SSc合并ILD亚组中ARRB1、CXCL10、CXCL16等多个基因的mRNA表达上调,但差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论:SSc合并ILD与SSc无ILD患者存在DNA甲基化和转录组表达谱的差异,且SSc患者PBMCs中存在Wnt/β-catenin和趋化因子信号通路多个基因表达上调,这可能与SSc的发病机制有关。

全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因中的作用

背景:全基因组表达谱芯片是一种用于基因表达研究的技术手段,具有高度敏感性以及特异性,它可以在全基因组范围内检测与慢性牙周炎相关的差异基因,从而高效快速地发现与慢性牙周炎密切相关的因子。目的:应用全基因组表达谱芯片筛选慢性牙周炎相关基因。方法:选取15例正畸拔牙患者正常牙周膜组织作为对照组,21例慢性牙周炎患者牙周组织。比对4例慢性牙周炎组织和4例正常组织的全基因组表达谱芯片,筛选出上调基因及下调基因。通过Real-Time PCR(7例正常及13例患者)和Western Blot(4例正常及4例患者)对2组牙周膜组织中差异基因PI3K-Akt信号通路的表达进行验证。实验方案由海南医学院第一附属医院伦理委员会批准(批准号:HNM20180034)并获得所有患者的知情同意。结果与结论:①全基因组表达谱芯片结果分析发现慢性牙周炎样本中均存在显著差异表达的上调基因1565个,下调基因1849个;②富集分析发现其中在慢性牙周炎中PI3K-Akt信号通路表达有显著差异(P<0.001);③Real-Time PCR及Western Blot检测发现PI3K及Akt的mRNA和蛋白在慢性牙周炎中较对照组表达高(P<0.05);④结果说明,全基因组表达谱芯片在筛选慢性牙周炎相关基因的改变时具有快速且高敏感度等特点。PI3K-Akt信号通路在慢性牙周炎表达出现明显差异,为慢性牙周炎的治疗提供实验依据。

伤寒沙门菌基因组DNA芯片的制备与基因表达谱分析应用

伤寒沙门菌是一种具有鞭毛的革兰阴性人类肠道致病菌,也是一种重要的原核生物研究用模式菌.基因组芯片能够系统、全面且高效地观察生物的基因表达及进行基因组结构比较.利用伤寒沙门菌现有的全基因组序列,以Ty2菌株的基因组为基准,选取CT18菌株和z66阳性菌株的特异性蛋白编码基因,设计特异性引物,经PCR有效扩增出4201个基因,产物纯化后点样于多聚赖氨酸玻片制备伤寒沙门菌基因组DNA芯片,并验证了芯片样点位次与效果.通过对基因表达谱分析的各种条件进行优化,建立相应的表达谱分析方法,并用于比较伤寒沙门菌野生株在高渗、低渗条件下的基因表达差异,结果与以前的报道基本一致.结果表明,成功建立了伤寒沙门菌基因组DNA芯片及表达谱分析方法,可为有关伤寒沙门菌基因表达调控及致病性机理、进化和基因多样性等方面的深入研究提供有效的技术支持.

幽门螺杆菌基因组表达谱芯片的研制

以H．pylori 26695和J99作为模板,采用多聚酶链反应(PCR)扩增得到所需要的开放阅读框(open read- ing frame,ORF)片段。使用Genemachine点样仪进行点样,采用随机九聚体、Cy3-dCTP或Cy5-dCTP和Super- scriptⅡ标记H．Pylori RNA标本,完成芯片杂交过程(?)数据判断标准是标化后Cy3/Cy5比值(ratio)≤0．5为基因表达上调,若ratio值≥2．0则为表达下调。采用芯片重复性、信噪比评估芯片质量,应用RT-PCR反应验证芯片结果。研制的H．pylori基因组DNA芯片共包括1636个ORF,其中H．pylori-26695为1549个,J99为87个。表达谱数据分析显示大多数阵列具有显著高于背景的杂交信号,信噪比(S/N)≥2的基因点数约占总基因数的87．76%。芯片内点间重复率约为94．05%。通过RT-PCR反应显示,在所选择的20个基因中,大部分基因的RT-PCR结果与芯片检测结果一致。

表达谱基因芯片技术及其在动物基因组研究中的应用

将对表达谱基因芯片的原理、分类、技术流程、优点和在动物基因组研究中的应用以及存在问题作一综述,并对其应用前景进行展望。

整合数字基因表达谱与全基因组关联分析鉴定猪血液性状候选基因

【目的】整合数字基因表达谱与全基因组关联分析鉴定白色杜洛克×二花脸F_2资源群体的血液性状候选基因。【方法】白色杜洛克×二花脸F_2资源群体在(240±3)d屠宰,收集血液于抗凝管中进行血常规检测。利用Illumina 60K SNP芯片对1 020头F_2资源群体进行基因分型。剔除基因型检出率<90%和孟德尔错误检出率>5%的个体。检出率<95%、次等位基因频率<5%、哈代-温伯格检验(HWE)P<5×10^(-6)、与性染色体连锁疑似常染色体的SNP被筛除。利用Illumina GA II测序仪测序对502头F_2资源群体的肝脏进行数字基因表达谱测序。测序得到的原始数据经过滤获得清洁标签后与参考标签数据库比对,将能唯一比对到参考基因序列的清洁标签数量进行标准化处理以获得标准化的基因表达量。每个转录本的表达水平进一步转化为lg2值。在少于20%的个体中表达的转录本被滤去。表型性状和基因表达性状使用R程序包中Gen ABEL内polygentic功能进行性别、批次和亲缘关系的校正。其残差使用R程序包中斯皮尔曼系数评估基因表达水平与表型数据的关联性,设定保守阈值P<5×10^(-4)时调整多重检验。将检测到的表达数量性状位点(eQTL)及其对应基因根据其位置相对照的关系进行绘图。搜寻前期GWAS最高点5.0 Mb区域内eQTL结合GWAS结果进行综合分析。Gene Ontology&KEGG pathway富集分析使用在线工具DAVID。基因共表达网络使用在线工具Gene MANIA进行构建。【结果】白色杜洛克×二花脸F_2资源群体中502个个体的20 108个肝脏转录本通过了质检。当P<5×10^(-4)时鉴别到与血红蛋白(HGB)、红细胞数目(RBC)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)和白细胞数目(WBC)关联的转录本共259个。有34个转录本与一个以上表型关联。用上述血细胞性状关联的转录本进行eQTL定位,当阈值P<10^(-5)时得到304个eQTL,每个转录本映射到1—6个eQTL,其中有35个顺式eQTL,120个反式eQTL。MCH和MCV的顺式eQTL位置重叠位于8号染色体。7号染色体存有数量最多的eQTL,其中多数为反式eQTL。通过eQTL定位确定了KIT为候选基因。Gene Ontology&KEGG pathway富集分析鉴别到与红细胞性状相关的基因KIT、PSEN2和TFRC,与白细胞性状相关的基因THBS1和CYR61。通过整合前期GWAS数据及eQTL定位并建立基因共表达网络,鉴定到与白细胞性状相关的基因RPS10。【结论】利用基于白色杜洛克×二花脸F_2资源群体的eQTL定位并结合前期GWAS数据,鉴别到与红细胞性状相关的基因KIT、PSEN2和TFRC,与白细胞性状相关的基因THBS1、CYR61和RPS10。

伤寒沙门菌基因组DNA芯片基因表达谱分析技术的建立与优化

目的:建立和优化基于伤寒沙门菌全基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术。方法:提取伤寒沙门菌野生z66阳性菌株总RNA,以6,9核苷酸随机引物(N6、N9)和(或)基因组特异引物(GDP)反转录合成cDNA,用荧光素Cy5或Cy3直接掺入标记后,与包括伤寒沙门菌4201个蛋白编码基因的伤寒沙门菌全基因组芯片杂交,用芯片扫描仪扫描后获得表达谱分析结果,经过数据标准化处理后进行分析。结果:采用N9+GDP混合引物,直接掺入法标记时,既能获得较好标记效果,又能节约试剂成本,同时可减少繁琐步骤所引起的不必要失误。结论:建立的基于伤寒沙门菌基因组DNA芯片的基因表达谱分析技术,为细菌的基因表达调控及功能基因组学研究提供了平台。

口腔鳞状细胞癌及癌旁正常组织基因表达谱芯片检测

背景:近年在整体水平上以高通量分子扫描手段为基础的基因组学、蛋白质组学以及计算机辅助设计等技术的整合及相互关联的"技术链"的应用已在乳腺癌、肺癌、胃癌、结肠癌、卵巢癌、黑色素瘤等的研究中取得了丰硕的成果,但关于口腔鳞状细胞癌的研究较少。目的:实验通过基因表达谱芯片检测口腔鳞状细胞癌组织与癌旁正常组织的基因表达谱。方法:收集广东省口腔医院2013年手术切除的口腔鳞癌及癌旁正常组织各2例,采用Roche Nimble Gen全基因组表达谱芯片进行口腔鳞癌及癌旁正常组织的基因表达谱检测。结果与结论:按差异基因筛选标准,从32 448条检测基因中筛选出口腔鳞癌肿瘤组织的差异基因共有7 872条,占筛选基因总数的24%;其中上调表达的基因有3 800条,下调表达的有4 072条。结果证实,通过基因表达谱芯片检测并根据表达差异1倍以上的筛选标准得到了7 872个表达差异的基因。由此可见肿瘤的发生发展不是单个或几个基因的作用结果,以往实验往往针对某个或某几个基因的研究有很大的局限性。同时也说明了肿瘤的产生是多基因成网络相互调节作用的结果,而且这个网络的作用关系是非常复杂的。

表达谱基因芯片在猪肉基因组研究中的应用

肌肉生长和品质是目前猪肉分子遗传基础研究的两个重要内容,通过候选基因法和基因组扫描法已鉴定出多个影响猪肉生长和品质的功能基因及若干QTLs,但是这些研究在一定程度上均表现出某些不足。表达谱基因芯片是基因芯片的一种,它具有大规模、高通量、缩微和平行处理等优点,为猪肉基因组学的研究提供了一项强有力的工具。本文将对表达谱基因芯片的原理、分类、技术流程、优点和在猪肉基因组研究中的应用以及存在问题作一综述并对其应用前景进行展望。

哮喘患儿外周血单个核细胞全基因组表达谱的差异研究

目的:筛选哮喘患儿与对照组儿童外周血的基因表达谱差异,寻找与哮喘防治相关的靶基因。方法:从5名哮喘患儿和5名对照组儿童外周血单个核细胞中提取总RNA,利用全基因组表达谱芯片进行检测,选取经非配对t检验计算所得P≤0.05、同时基因表达变化≥2倍的差异表达基因,以荧光定量PCR(qRT-PCR)验证芯片结果。通过生物信息学软件对初步筛选的差异基因进行层次聚类分析和Gene Ontology(GO)功能分类分析。结果:从45 033条表达基因谱中筛选出哮喘患儿与对照组儿童差异表达2倍以上且P≤0.05的已命名基因758个(含上调基因345个,下调基因413个),其GO生物学过程功能分类主要涉及免疫反应、对外部刺激的反应、信号转导及分子功能的负性调节、细胞死亡、凋亡及其调节等。其中有29个基因与哮喘、气道炎症或气道重构有关,且变化趋势与文献报道一致(含上调基因14个,下调基因15个),并可被层次聚类分析划分为9类。qRT-PCR验证结果与芯片结果一致。结论:用全基因组表达谱芯片可以筛选出哮喘患儿与对照组儿童外周血单个核细胞中的差异表达基因,进一步的数据挖掘很可能寻找到与哮喘防治相关的靶基因或靶通路。

宫颈癌及癌前病变的全基因组表达谱分析及下调表达候选基因鉴定

目的探讨维吾尔族妇女宫颈癌组织特异的下调表达基因谱,建立基于下调表达基因的宫颈癌早期诊断方法。方法收集维吾尔族妇女宫颈病变新鲜组织标本72例,其中宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcino-ma,CSCC)25例,宫颈内上皮瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)22例,正常宫颈组织(normal cervix,NC)25例。选择20例组织标本(CSCC 7例,CINⅢ6例,NC 7例),提取组织RNA,通过人类全基因组表达谱芯片及生物信息分析,筛选宫颈癌及癌前病变(CIN)特异性下调表达候选基因。通过对CSCC与正常对照(NC)组的基因差异表达谱进行比较分析,选取10种差异表达倍数较高的候选基因,利用72例宫颈病变组织RNA,对10种下调表达候选基因的表达水平进行半定量RT-PCR鉴定,确定宫颈癌及癌前病变与该基因表达水平变化的关系。结果以2倍及以上表达差异为量化标准,有下调表达候选基因112种。72例宫颈病变组织RNA的半定量RT-PCR筛查分析,发现在CSCC与正常对照组之间,FOSB、DNASE1L3、SCARA5、EGR1、ABI3BP、FOS、KLF4、RHOB、IER2和ID4等10种下调表达基因的差异均有统计学意义(P<0.05)。DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF4和IER2等5种基因的表达水平差异在CIN与正常对照组之间有统计学意义(P<0.05),但是除了FOS基因外,其余4种基因表达在CSCC与CIN组之间无差异(P>0.05)。结论维吾尔族妇女宫颈癌发病进程可能与一系列基因的下调表达密切相关,而DNASE1L3、EGR1、FOS、KLF4和IER2等5种基因的表达水平变化可能成为宫颈癌早期预警指标。

用聚类法分析受抗真菌物质处理后的酵母细胞全基因表达谱

微阵列DNA芯片技术可以并行分析成千上万个基因的表达情况 ,它为研究药物的作用机制提供了一个新的高效技术平台 .用 9种已知和未知作用机理的抗真菌化合物处理酵母细胞 ,并得到酵母细胞的全基因表达谱 ,然后对其进行聚类分析 .结果表明作用机制类似的化合物具有相近的聚类关系 .两性霉素B和制霉菌素、酮康唑和克霉唑都是已知的作用机制类似的抗真菌药物 .通过对基因表达谱进行聚类分析 ,发现前一组和后一组分别被聚类在一起 .另外已知澳洲茄胺抑制的是细胞膜上麦角固醇的合成 ,聚类分析表明它与酮康唑 ,克霉唑的聚类很靠近 .对微阵列DNA芯片产生的基因表达谱进行聚类分析 ,由于作用机制相似的药物会被聚类在一起 ,因此根据未知药物和已知药物的聚类关系 ,可以了解未知药物的作用机制 。

汉族和高加索人糖尿病肾病肾小球全基因组表达数据分析

目的:观察中国汉族和高加索糖尿病肾病(DN)患者肾小球内差异表达基因和发生调节的分子信号通路的异同。方法:分别选取中国汉族DN患者29例和正常对照5例,高加索DN患者21例及正常对照35例,微分离肾小球进行全基因组数据表达检测,分析不同人种DN患者与正常对照相比出现差异表达的基因;分析两个人种DN患者肾小球内与估算的肾小球滤过率(eGFR)变化相关的表达基因;比较差异表达基因与eGFR变化相关基因在两个人群中的异同。结果:(1)中国汉族DN患者肾小球中有565个基因存在差异表达,高加索DN患者肾小球中有775个基因存在差异表达;(2)比较分析提示,有200个基因在两个人种均存在差异表达。分子通路分析提示,共有13条信号通路在两个人种中均发生调节,其中大部分为免疫炎症反应相关性通路;(3)中国汉族人群中有225个基因与eGFR明显相关;而在高加索人群中有293个基因与eGFR明显相关。比较分析提示,共有CRISPLD2、SPON1、LUM等55个基因在两个人种中均与eGFR水平明显相关。结论:通过比较分析中国汉族人群和高加索人群DN患者肾小球全基因组表达谱的异同发现,免疫炎症通路在不同人种DN的发生发展中均发挥重要作用。同时,我们还证实了55个与DN患者肾功能改变明显相关的基因,可作为判断DN患者疾病进展分子标志物的候选基因进行研究验证。

基于十二指肠全基因表达谱研究模型大鼠脾虚湿阻的分子机制

目的:研究脾虚水湿不化大鼠脾虚湿阻的分子机制。方法:20只Wistar大鼠随机分为模型组和正常对照组,每组10只。高脂低蛋白加负重力竭游泳复合因素诱导6周,建立脾虚水湿不化大鼠模型。Agilent全基因组表达谱芯片检测大鼠十二指肠组织基因表达谱变化,筛选差异基因,基于基因本体数据库(GO)进行基因功能分类,基于《京都基因与基因组百科全书(KEGG)》数据库进行信号通路分析,实时荧光定量PCR验证部分基因Tff2和Trpm6表达。结果:与正常对照组比,模型大鼠筛选出1275个差异表达基因,上调660个,下调615个。GO分析结果显示差异基因生物学过程主要包括跨膜转运、免疫应答、铁离子稳态等,分子功能主要包括水通道活性、磷脂酶D活性、受体活性、氧化还原酶活性等,细胞组分包括微绒毛、刷状缘膜等。信号通路主要包括矿物质吸收、补体级联反应、细胞因子-细胞因子相互作用、钙离子信号通路、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢通路。结论:模型大鼠十二指肠组织参与消化吸收、水及离子代谢、免疫功能的基因出现异常,其脾虚湿阻的机制涉及矿物质吸收、钙离子信号通路、补体激活通路及甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢等。

一份水稻寡分蘖近等基因系的构建及全基因组差异表达分析

利用水稻寡分蘖突变体G069与广亲和材料02428杂交和连续回交,建立了寡分蘖基因在02428基因组背景下的近等基因系02428-ft1.在分蘖始期对其分蘖节位的石蜡切片观察表明,寡分蘖基因抑制了水稻侧芽的发生。利用含有59712个预测基因或已知基因的表达特征序列的基因芯片进行全基因组表达谱分析,结果表明共有136个cDNA克隆的表达在近等基因系02428-ft1中发生了变化,其中27个被激活,30个沉默,受到了寡分蘖基因的明显调控。功能分析表明,这些受寡分蘖基因调控的基因功能分布较为广泛,包括转录因子、激酶、功能蛋白和调节蛋白等,为水稻分蘖调控机制的研究提供了相关信息。

基因芯片在研究病毒感染宿主基因表达谱中的应用

人类基因组计划提供的海量基因信息以及功能基因组学理论和技术的出现,为研究病毒与宿主相互作用提供了难得的历史机遇。病毒作为一种严格的细胞内寄生物,感染宿主后会引起宿主细胞形态和功能的改变。这些变化主要由于病毒感染导致宿主细胞基因表达变化所引起。通过基因芯片技术研究病毒感染宿主的基因表达谱变化,可以发现病毒感染宿主细胞在分子水平上的应答,从而为病毒性疾病的预防、诊断和临床治疗提供新的策略。

饲粮蛋白质源对断奶仔猪小肠全基因组转录谱的影响

为探讨饲粮蛋白质源影响断奶仔猪小肠发育的分子机制，本试验利用猪全基因组表达谱芯片分析不同蛋白质源饲粮下断奶仔猪（断奶0、3、7和14d）小肠转录谱，24头仔公猪随机分为2个处理，处理1采用乳源蛋白质30％替代饲粮总蛋白质，处理2采用全植物蛋白质源饲粮。

利用肾小球全基因组表达数据筛选治疗糖尿病肾病的药物

目的:利用2型糖尿病肾病(T2DN)患者微分离的肾小球全基因组表达数据,借助关联性图谱(CMAP)数据库和生物信息学方法,探寻具有T2DN治疗作用的潜在药物。方法:选取中国汉族T2DN患者23例和正常对照6例,微分离肾小球,利用Affymetrix U133 Plus 2.0全基因组表达谱芯片检测获得基因表达数据,获得T2DN患者不同分期之间的差异表达基因后,进一步通过2种不同的生物信息学方法寻找T2DN的潜在治疗药物,并阐明其可能的分子作用机制。结果:利用T2DN晚期和早期相比的差异表达基因和CMAP数据库,筛选出小白菊内酯(parthenolide)、荜茇酰胺(piperlongumine)、15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)和LY-294002(PI3K抑制剂)等候选药物。上述药物能够逆转T2DN患者在疾病进展过程中肾小球基因表达的变化,提示这些药物可能具有治疗T2DN的潜能。既往研究证实这些药物对T2DN有一定的治疗作用,验证了该药物筛选方法的可靠性。结论:利用T2DN患者肾小球全基因组表达谱和CMAP数据库能够快速筛选出具有T2DN治疗潜能的药物,候选药物可进行下一步的动物实验和临床试验以证实其治疗的安全性和有效性,应用前景广阔。