LncRNA MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA/B介导结直肠癌细胞免疫逃逸

目的:探究长链非编码RNA母系表达基因8(LncRNA MEG8)通过靶向miR-15a-5p调控MHCⅠ类相关蛋白A/B(MICA/B)介导的结直肠癌(CRC)细胞免疫逃逸机制。方法:RT-qPCR、Western blot检测CRC组织和细胞系MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平;双荧光素酶实验验证MEG8对miR-15a-5p的调控关系;采用脂质体转染法将NC、MEG8、miR-NC、miR-15a-5p分别或共转染至SW480、SW620细胞,记为NC组、MEG8组、MEG8+miR-NC组、MEG8+miR-15a-5p组;将NK细胞分别与SW480、SW620细胞共培养;ELISA检测共培养液中TNF-α、IFN-γ水平;CCK-8、EdU染色、Transwell实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力;RT-qPCR、Western blot检测细胞MEG8、miR-15a-5p、MICA、MICB、NKG2D蛋白水平。结果:与癌旁组织或正常结肠上皮细胞相比,CRC组织和细胞系中MEG8、MICA、MICB、NKG2D mRNA和蛋白水平降低,miR-15a-5p水平升高(P<0.05)。MEG8靶向调控miR-15a-5p。共培养体系中,与NC组相比,MEG8组细胞MICA、MICB、NKG2D蛋白水平、共培养上清液中TNF-α、IFN-γ水平明显升高,培养1 d、2 d、3 d后,OD值、EdU阳性率、迁移和侵袭细胞数明显降低(P<0.05);过表达miR-15a-5p能部分逆转过表达MEG8对细胞MICA、MICB、NKG2D、TNF-α、IFN-γ水平和增殖、侵袭转移能力的影响(P<0.05)。结论:MEG8通过靶向miR-15a-5p调控MICA、MICB表达,促进NK细胞活性,抑制CRC细胞免疫逃逸。

BRAF、TP53、Pax8-PPARγ在甲状腺癌中的表达及疗效预测价值

目的探讨肿瘤蛋白P53(TP53)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(BRAF)、配对盒基因8-过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Pax8-PPARγ)在甲状腺癌中的表达及疗效预测价值。方法将2020年4月至2022年4月该院收治的150例甲状腺癌患者纳入研究。检测患者甲状腺癌组织及癌旁组织中TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA的表达水平,分析其与临床病理因素的关系,基于受试者工作特征(ROC)曲线及决策曲线分析TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA表达水平预测^(131)I治疗效果的价值。结果甲状腺癌组织中的TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA表达水平高于癌旁组织(P<0.05)。甲状腺癌患者淋巴结转移、肿瘤最大径、包膜浸润与TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA表达水平有关(P<0.05)。采用放射性^(131)I清除术后残留的甲状腺组织(简称清甲)失败患者组织TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA表达水平均高于清甲成功患者(P<0.05)。ROC曲线分析显示,TP53、BRAF、Pax8-PPARγmRNA联合预测甲状腺癌患者清甲失败的曲线下面积优于三者单独预测(P<0.05)。决策曲线显示,三者联合预测甲状腺癌清甲失败发生的净收益率优于单一预测(P<0.05)。结论TP53、BRAF、Pax8-PPARγ在甲状腺癌组织中呈高表达,联合检测有助于预测^(131)I治疗效果,为临床确定合理治疗方案及时机提供参考。

长链非编码RNA母系表达基因8通过微小RNA-495-3p调控急性髓性白血病细胞高迁移率族蛋白A1表达及对细胞增殖、凋亡的作用机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(lncRNA)母系表达基因8(MEG8)通过微小RNA-495-3p(miR-495-3p)调控急性髓性白血病细胞(AML)高迁移率族蛋白A1(HMGA1)表达及对细胞增殖、凋亡的机制。方法:选取50例经确诊为AML患者的骨髓活检标本与52例健康骨髓捐赠者骨髓标本,常规培养人AML细胞株HL-60,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法骨髓单个核细胞中lncRNA MEG8 mRNA表达。将HL-60细胞分为六组,即HL-60组(HL-60细胞)、si-NC组(转染si-NC)、si-lncRNA MEG8组(转染si-lncRNA MEG8)、mimic-NC组(转染mimic-NC)、miR-495-3p mimic组(转染miR-495-3p mimic)、si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组(转染si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic),CCK-8法检测培养24、48、72 h各组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞中HMGA1表达,双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MEG8、miR-495-3p、HMGA1之间的关系。结果:与对照组相比,观察组lncRNA MEG8 mRNA表达升高(P<0.05)。与miR NC+MEG8 WT组比较,miR-495-3p mimic+MEG8 WT组荧光素酶活性下降(P<0.05),与miR NC+HMGA1 WT组比较,miR-495-3p mimic+HMGA1 WT组荧光素酶活性下降(P<0.05)。与HL-60组、si-NC组、mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8组、miR-495-3p mimic组和si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组24、48 h细胞增殖能力均显著下降,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组细胞增殖率最低(P<0.05)。与HL-60组、si-NC组和mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组HL-60细胞凋亡率高于si-lncRNA MEG8组和miR-495-3p mimic组(均P<0.05)。与HL-60组、si-NC组和mimic-NC组比较,si-lncRNA MEG8+miR-495-3p mimic组HMGA1蛋白表达低于si-lncRNA MEG8组和miR-495-3p mimic组(均P<0.05)。结论:沉默lncRNA MEG8可能通过上调miR-495-3p来下调HMGB1,来抑制HL-60细胞的恶性生物学行为,可为探索AML潜在治疗靶点提供了新思路。

黄瓜类钙调蛋白CML8与性型分化主效基因编码蛋白的互作分析

【目的】为探索类钙调蛋白CMLs是否参与黄瓜性型分化过程,以便进一步完善性型分化调控网络提供参考。【方法】通过克隆黄瓜CML8、ACS1G、ACS2及ACS11基因,qPCR检测CML8基因在不同花型中的表达量,酵母双杂交检测CML8与黄瓜性型分化主效基因编码蛋白间的互作情况。【结果】克隆得到黄瓜CML8基因,完整ORF 441 bp,编码146 aa,不含信号肽;不含跨膜域,为胞外蛋白,含4个具有Ca^(2+)结合能力的EF-hand结构域,不含内含子,亚细胞定位在细胞膜和细胞质;克隆得到黄瓜性型分化关键基因F(ACS1G)、M(ACS2)及A(ACS11),序列比对表明三者的基因序列及编码蛋白序列与黄瓜数据库中的一致,且在雌花、雄花和两性花3种不同花型中的表达量差异显著,在雄花中差异极显著;酵母双杂交试验表明,CML8均可与ACS1G和ACS2发生互作,而不能与ACS11发生互作。【结论】成功克隆得到黄瓜CML8基因,且CML8可与ACS1G和ACS2发生互作,可能参与黄瓜性型分化过程,本研究首次探索类钙调蛋白参与植物性型分化过程,期望为钙信号系统参与植物性型分化提供参考。

CK7/SATB2/PAX8与肿瘤大小/侧向鉴别原发与下消化道转移性卵巢黏液癌

目的探讨细胞角蛋白7(CK7)、特殊的含AT序列的结合蛋白2(SATB2)、配对盒基因8(PAX8)联合肿瘤大小、侧向性鉴别诊断原发性与下消化道转移性卵巢黏液癌的意义。方法选取原发性卵巢黏液性肿瘤(PMOC)标本74例,下消化道转移性卵巢黏液癌(MMOC)标本16例,统计肿瘤大小、侧向性,免疫组化方法检测标本CK7、SATB2、PAX8、细胞角蛋白20(CK20)及尾型同源盒转录因子2(CDX2)的表达,分析上述指标在二者鉴别诊断中的意义。结果CK7、PAX8在PMOC组织阳性表达率高于MMOC(P=0.000、0.000),SATB2、CK20、CDX2在MMOC组织阳性表达率高于PMOC(P=0.000,χ^(2)=14.16~17.30,P<0.05);CK7、PAX8、SATB2联合肿瘤大小、侧向性诊断PMOC的准确度分别为82.2%、76.7%、74.4%,CK7/CDX2/CK20诊断PMOC的准确度为76.6%,CK7/PAX8/SATB2/大小/侧向性诊断PMOC准确度、灵敏度、特异度、约登指数分别为94.4%、93.2%、100.0%、93.2%。结论单个指标CK7、PAX8、SATB2可以鉴别PMOC与MMOC,联合肿瘤大小、侧向性诊断效能显著提高。

尿路上皮癌组织中PAX-8、GATA-3的表达与临床病理特征的相关性

目的:探讨尿路上皮癌组织中配对盒基因8(PAX-8)、GATA-3的表达与临床病理特征的相关性。方法:于2020年1月—2022年1月选取本院144例尿路上皮癌患者的石蜡标本和100例癌旁正常尿路上皮组织标本进行研究,将尿路上皮癌患者的石蜡标本作为观察组,另将癌旁正常尿路上皮组织标本作为对照组,分别对其PAX-8、GATA-3表达阳性率进行检测,并分析PAX-8、GATA-3表达与尿路上皮癌组织临床病理特征的相关性。结果:观察组PAX-8表达阳性率明显高于对照组,GATA-3表达阳性率明显低于对照组(P<0.05);PAX-8阳性与阴性的性别、年龄、病变部位、组织学分级、有无组织浸润、有无淋巴结转移、有无复发、肿瘤直径、有无脉管癌栓比较无统计学差异(P>0.05);PAX-8阳性与阴性的远处转移、分期比较存在显著差异(P<0.05)。GATA-3阳性与阴性的性别、年龄、病变部位、有无组织浸润、有无淋巴结转移、有无复发、肿瘤直径、有无脉管癌栓、有无远处转移比较无统计学差异(P>0.05);GATA-3阳性与阴性的组织学分级、分期比较存在显著差异(P<0.05)。PAX-8表达与分期、远处转移呈正相关性(P<0.05);GATA-3表达与组织学分级、分期呈负相关性(P<0.05)。结论:尿路上皮癌组织中,PAX-8表达主要呈现出异常上调的情况,而GATA-3表达则明显下降,提示PAX-8、GATA-3均可能参与尿路上皮癌的发生发展过程中,临床可通过PAX-8、GATA-3表达水平的变化对癌组织的分期、淋巴结转移、远处转移等情况进行预测,有助于为治疗方案的制定提供科学的参考依据。

含绿色荧光蛋白基因与人疱疹病毒8型K12基因重组真核表达载体的构建

目的:构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人疱疹病毒8型K12基因的重组真核表达载体。方法:将人疱疹病毒8型(HHV-8)K12基因插入到真核表达质粒pCR3.1的EcoRI和XhoI位点,构建重组质粒pCR-K12;PCR扩增GFP基因,将GFP基因插入到重组质粒pCR-K12中K12上游的KpnI和EcoRI位点中,获得重组表达质粒pCR-GFP-K12。结果:重组表达质粒pCR-GFP-K12的酶切鉴定符合预期结果,此重组质粒中的K12与GFP融合表达并受上游启动子pCMV控制。结论:重组表达质粒pCR-GFP-K12已构建成功,为研究K12的生物学活性及其作用机制打下基础。

不同的引导肽对丝状噬菌体基因8蛋白展示外源多肽的影响

为了研究不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的影响,利用基因工程方法将一短肽插入基因8蛋白的N端,并将引导多肽去除或用基因3蛋白的引导肽序列替代基因8的引导肽序列.采用放射性脉冲追踪技术检测不同的引导肽对在基因8蛋白上展示外源多肽的作用.结果表明,无引导肽序列的引导,蛋白前体无法向成熟蛋白转化.基因3蛋白的引导肽可以引导展示有外源多肽的基因8蛋白,完成从前体向成熟蛋白的转化,但转化率明显下降.研究结果对阐明噬菌体外壳蛋白在大肠杆菌中的跨膜机制具有重要的意义.

成年及幼年Long-evans大鼠视皮层HSP8基因的表达差异

目的:观察热休克蛋白8(heat shock protein 8,HSP8)基因在幼年和成年Long-evans大鼠视皮层中的表达水平,探讨其在视觉可塑性关键期中的作用。方法:采用半定量RT-PCR方法,分析处于视觉可塑性关键期内的幼年Long-evans大鼠和处于视觉可塑性关键期后的成年Long-evans大鼠视皮层中HSP8基因的表达水平。结果:幼年大鼠和成年大鼠视皮层间HSP8mRNA表达量有显著性差异,成年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.68±0.03,幼年大鼠视皮层中HSP8/G3PDH为0.14±0.06,HSP8mRNA在成年大鼠视皮层中表达水平显著高于幼年大鼠(P<0.05)。结论:HSP8基因在视觉可塑性关键期后的成年大鼠视皮层中呈高水平表达,是视觉可塑性关键期终止相关的候选基因。

Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调

目的:观察Pax-8基因在ALK3基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况,探讨Pax-8基因在心脏发育中的作用。方法:基因芯片(microarray)和定量逆转录-聚合酶链反应测定ALK3基因的下游基因,免疫组化法检测13.5 d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除小鼠胚胎中Pax-8蛋白的表达,连续病理切片及HE染色观察刚出生的Pax-8基因敲除小鼠的心脏形态。结果:在心脏特异的ALK3基因敲除小鼠中,转录因子Pax-8基因mRNA的表达水平上被下调7.1倍。免疫组化结果显示:13.5 d小鼠胚胎心脏特异性ALK3基因敲除的纯合子小鼠Pax-8基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax-8基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚,心脏呈球形。结论:Pax-8基因是ALK3基因的下游基因,与心脏发育有密切关系。

PAX-8蛋白在宫颈腺上皮病变鉴别诊断中的作用

目的探讨配对盒基因8(PAX-8)蛋白在宫颈腺上皮病变鉴别诊断中的作用。方法收集25例良性宫颈腺上皮(BEG)、14例原位宫颈腺癌(AIS)、19例浸润性宫颈腺癌(ECA)和20例子宫内膜样腺癌(UEC)活检或手术标本,应用免疫组织化学染色检测各组织中PAX-8蛋白的表达情况。结果 PAX-8蛋白在BEG中呈弥漫性的强阳性核表达,在AIS和浸润性ECA中呈斑片或局灶性的弱阳性核表达。PAX-8蛋白在BEG、AIS、浸润性ECA组织中的阳性表达率分别为100%(25/25)、92.8%(13/14)、73.7%(14/19),其中BEG的PAX-8蛋白阳性表达率高于浸润性ECA,而BEG与AIS、AIS与浸润性ECA的PAX-8蛋白阳性表达率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。PAX-8蛋白在UEC组织中的阳性表达率为100.0%(20/20),高于浸润性ECA(P<0.05)。结论 PAX-8在宫颈腺上皮良性与恶性病变以及浸润性ECA与UEC的鉴别诊断中具有一定的作用。

丝裂原活化蛋白激酶8基因在3T3-L1细胞诱导分化中表达水平的变化及肿瘤坏死因子-α对其调节的作用

目的 观察丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化，探讨TNF-α1对成熟脂肪细胞中MAPK8基因表达水平的调节作用，分析MAPK8基因与脂肪细胞分化、脂质形成及肥胖问的关系。方法体外培养3T3-L1脂肪前体细胞，在诱导其分化成熟的基础上，采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时段（0～10d）脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平；应用重组TNF-α（0．1，1．0，10．0μg／L）干预分化成熟的脂肪细胞，采用RT-PCR技术检测1NF-α干预后不同时间（0．5，2，6，12，24h）脂肪细胞中MAPK8基因的表达水平。结果 1．3T3-L1前体脂肪细胞中，MAPK8基因表达水平较高。应用地塞米松（DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（MIX）、胰岛素后脂肪细胞逐渐分化成熟，MAPK8基因mRNA表达水平逐渐减低。MAPK8基因表达水平除在诱导分化前至d4、d2～5、d6～10时段内无显著性差异外（P均〉0．05），余各时段问表达水平均有显著差异（P均〈0．01）；2．不同浓度重组TNF-α干预成熟脂肪细胞，均能显著上调MAPK8基因的表达，并呈现随TNF-α浓度增加、刺激时间延长，表达调控作用逐渐增强的总体趋势。TNF-α浓度为0．1μg／l，时，MAPK8基因的表达水平于干预12h时间点开始出现明显上调；浓度增加至1．0μg／L,时，MAPK8基因表达水平开始显著上调的时间点提前至干预2h时，但24h时间点的表达水平未见继续上调；TNF-α浓度为10．0μg／L时，除2h时间点MAPK8基因表达开始显著上调外，12～24h时段的表达也呈上调趋势。结论 1．MAPK8基因在3T3-L1细胞分化过程中表达逐渐下调，其机制可能有利于脂肪细胞的分化成熟和脂质积聚，与肥胖发生有关；2．TNF-α能够上调成熟脂肪细胞中MAPK8基因的表达，其效应总体趋势上呈现剂量及时间反应性特征。

下调T细胞肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)促进T细胞增殖并增强其免疫活性

目的利用RNA干扰技术沉默小鼠脾脏T淋巴细胞肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)基因表达,观察TIPE2基因沉默对T淋巴细胞增殖及免疫活性的影响。方法磁珠分选T739小鼠脾脏T细胞,采用Western blot法筛选能有效沉默T淋巴细胞TIPE2基因的小干扰RNA(siRNA)序列。采用TIPE2特异性siRNA、阴性对照siRNA转染T细胞,在转染24 h后,流式细胞术检测T细胞表面CD69水平;转染72 h后,CCK-8法检测转染T淋巴细胞增殖情况,同时,ELISA检测转染T细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)和γ干扰素(IFN-γ)分泌水平。结果成功筛选出特异性沉默TIPE2水平的siRNA序列,下调TIPE2基因表达后,T细胞CD69水平增加;T淋巴细胞增殖能力显著增强,IL-2和IFN-γ水平增加。结论下调TIPE2基因水平,促进T淋巴细胞增殖和免疫活性。

MyD88缺去突变基因转染降低病原菌感染的人呼吸道上皮细胞IL-8的分泌

白细胞介素-8(1L-8)是呼吸道炎症反应的重要介质。本实验通过构建突变M yD 88真核表达质粒(M yD 88 DN),转染人呼吸道上皮细胞株A 549及SPC-A-1,探讨其对病原菌感染上皮细胞IL-8表达的影响。结果显示:M yD 88 DN转染可降低结核杆菌、绿脓杆菌培养上清诱导的IL-8释放;对肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌活菌侵袭细胞所刺激的IL-8分泌也有明显的阻断作用。提示突变M yD 88能够阻断细菌感染引起的呼吸道上皮细胞IL-8表达,可能成为呼吸道严重炎症反应基因治疗的新靶基因。

FasL和Caspase-8蛋白表达及Caspase-8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值研究

目的探讨Fas L和Caspase-8蛋白表达及Caspase-8基因甲基化在非小细胞肺癌中的应用价值。方法选取手术切除的非小细胞肺癌患者100例,均分别切除癌组织和癌旁组织(以肿瘤为中心6 cm为半径的肺组织),其中肺鳞癌55例,肺腺癌30例,肺腺鳞癌15例;低分化癌50例,中分化癌30例,高分化癌20例;伴有淋巴转移65例,无淋巴转移35例。另取正常肺内组织100例进行对照。采用免疫组化S-P染色法检测非小细胞肺癌标本Fas L和Caspase-8蛋白表达;采用甲基化特异性聚合酶链式反应检测非小细胞肺癌组患者的Caspase-8基因甲基化状态。结果 Fas L蛋白主要散布在肿瘤细胞浆液中,少数排列在细胞膜上;Caspase-8蛋白散布于细胞浆液中。在非小细胞肺癌中,Fas L蛋白及Caspase-8蛋白存在不同程度的阳性表达,Fas L蛋白阳性表达率明显大于癌旁组织和正常组织,在肺腺癌的阳性表达率明显大于鳞癌及腺鳞癌(P<0.05),在低分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及高分化癌,伴淋巴转移Fas L蛋白阳性率大于非淋巴转移,差异均有统计学意义(P<0.05);而Caspase-8蛋白阳性表达率明显小于癌旁组织和正常组织,在肺腺癌的阳性表达率明显小于鳞癌及腺鳞癌,在高分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及低分化癌,伴淋巴转移Caspase-8蛋白阳性率低于非淋巴转移,差异均有统计学意义(P<0.05)。癌组织Caspase-8基因甲基化率明显大于癌旁组织和正常组织,在肺腺癌的阳性表达率明显大于在鳞癌及腺鳞癌的阳性表达率,在低分化癌中的阳性表达率明显大于中分化癌及高分化癌,伴淋巴转移Caspase-8基因甲基化阳性率高于非淋巴转移,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论非小细胞肺癌中出现Fas L蛋白高表达和Caspase-8基因高甲基化的变化,加快肺癌细胞与免疫细胞联合的速率,抑制免疫细胞的活性,致使肿瘤内部形成无免疫区域而促进肿瘤细胞的分裂和滋长,成为腺癌较易发生早期转移的重要原因。Caspase-8蛋白在鳞癌中表达增高,这是鳞癌预后较好的主要因素,也是判断非小细胞肺癌预后的重要指标之一。Caspase-8参与了非小细胞肺癌的演变,与非小细胞肺癌的发生、发展及转移有密切关系,作为非小细胞肺癌预后的重要指标,为临床对非小细胞肺癌进行综合性、针对性的治疗提供了重要理论依据。

幽门螺杆菌诱导胃上皮细胞白细胞介素-8基因转录的信号转导机制

背景:亚洲与欧美国家的幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因致病岛(cagPAI)存在地域差异,但此种差异与胃上皮细胞白细胞介素(IL)-8基因转录信号转导机制之间的关系尚不明确。目的:探讨我国H.pylori菌株诱导胃上皮细胞IL-8基因转录的信号转导机制。方法:以DNA杂交法分析长海医院5株临床分离H.pylori菌株的cagPAI状态。将含IL-8报告基因的人胃上皮细胞系L5F11分别与5株H.pylori共培养,或与各蛋白激酶(PK)抑制剂预作用1h后再行共培养,用液体闪烁计数仪测定L5F11细胞的荧光素酶活性(IL-8基因转录),用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-8蛋白浓度。结果:在所分离的5株临床H.pylori菌株中,4株具有完整的cagPAI,1株cagPAI部分丢失。蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂除莠霉素A不仅能显著抑制H.pylori诱导的L5F11细胞的荧光素酶活性(P<0.05或P<0.01),而且能抑制其IL-8蛋白的分泌(P<0.05或P<0.01);PKG抑制剂KT5823和PKC抑制剂抑激酶素C对H.pylori诱导的IL-8基因转录和蛋白分泌均无影响。结论:与欧美国家的H.pylori菌株一样,本研究临床分离的H.pylori菌株亦通过PTK途径诱导胃上皮细胞IL-8基因转录。

幽门螺杆菌cagⅡ对胃上皮细胞IL-8基因转录的影响机制

[目的]探讨Hp cagⅡ对胃上皮细胞IL-8基因转录的影响及信号传导机制。[方法]构建cagⅡ基因位点缺失Hp突变以及带有IL-8报告基因的人胃癌细胞系L5F11，用液体闪烁计数仪测定荧光素酶(IL-8转录)活性．川ELISA法测定IL-8蛋白浓度。[结果]所有HP突变株诱导荧光素酶活性与IL-8蛋白浓度较亲代菌株26695均降低(0.13±0.01vs 0.59±0.05×10^4epm．P<0.01;0.73=0.13vg 2.22±0.65ng/ml．P<0.05)。PTK抑制berbimycin A不仅抑制Hp诱导的荧光素酶活性（0.71±0.18vs1.51=0.23×10^6epm，P<0.05)．而且抑制IL-8蛋白表达(0．83±0.41vs3.22±0.59ng/ml，P<0.05)，但berbimycinA对TNFa诱导的荧光素酶活性及IL-8蛋白表达均无影响(P均＞0.05)；PKA抑制剂H7抑制NTFa诱导的荧光素酶活性(0．74±0.16vs2.62±0.26×10^6epm．P<0.01)及IL-8蛋白表达(1．45±0.38vs4.12±0．43ng/ml，P<0.01)．而对Hp诱导的荧光素酶活性无影响(P>0.05)。[结论]Hp cag Ⅱ中的多个基因能够调节胃上皮细胞IL-8基因转录，且这一作用主要经蛋白酯氨酸激酶途径。

人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体的构建与鉴定

目的:构建人NOD8基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体。方法:用特定的限制性内切酶位点,以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD8基因启动子不同长度2段序列,并进行酶切以切除启动子的pEGFP-C2作框架结构,插入表达载体pEGFP-C2中,构建含有人NOD8基因启动子驱动的绿色荧光蛋白载体pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp),用VspⅠ和NheⅠ双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体(lipofectam ine)TM2000介导转染HEK293、K562和HeLa细胞,转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察。结果:pEGFP-C2-NOD8(520 bp)、pEGFP-C2-NOD8(760 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的2段重组质粒转染HEK293、K562及HeLa细胞均能表达绿色荧光,其中构建的pEGFP-C2-NOD8(760 bp)重组质粒绿色荧光表达强于pEGFP-C2-NOD8(520 bp)。结论:成功构建2段不同长度的人NOD8基因启动子绿色荧光蛋白表达载体。

肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2在T细胞发育过程中的表达及其对哮喘发病的潜在作用

目的探讨肿瘤坏死因子α诱导蛋白8样分子2(TIPE2)在T细胞发育过程中的表达及作用,分析其在哮喘发病中的潜在作用。方法选择C57BL/6J雌性野生型(WT)小鼠、C57BL/6J雄性TIPE2基因敲除(Tipe2^(-/-))小鼠、C57BL/6J雄性绿色荧光蛋白敲入(Tipe2^(gfp/+))小鼠为研究对象。取WT和Tipe2^(gfp/+)小鼠结肠组织和胸腺组织,获取肠道固有层淋巴细胞(LPLs)和胸腺细胞,采用流式细胞术检测结肠组织CD45-细胞、CD45+细胞及双阴性(DN)T细胞、双阳性(DP)T细胞、CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞中TIPE2的表达。取WT和Tipe2^(-/-)小鼠外周血、脾脏和肠系膜淋巴结,采用流式细胞术检测外周血、脾脏和肠系膜淋巴结中CD4^(+)和CD8^(+)T细胞水平。将10只Tipe2^(gfp/+)小鼠随机分为对照组和哮喘组,每组5只。哮喘组小鼠以卵清蛋白诱导哮喘模型,对照组小鼠以生理盐水代替卵清蛋白诱导;采用流式细胞术检测2组小鼠肺泡灌洗液中CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞中TIPE2的表达。结果WT和Tipe2^(gfp/+)小鼠结肠组织LPLs中,大部分TIPE2+细胞表达免疫细胞的标志分子CD45,几乎所有的CD45-基质细胞不表达TIPE2。Tipe2^(gfp/+)小鼠结肠组织中基质细胞和WT小鼠免疫细胞中检测不到TIPE2+细胞。Tipe2^(gfp/+)小鼠胸腺组织DN T细胞中TIPE2相对表达量显著低于CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞(t=53.312、8.230,P<0.01);DP T细胞中TIPE2相对表达量显著低于CD4^(+)T细胞和CD8^(+)T细胞(t=21.094、6.405,P<0.001);DN T细胞中TIPE2相对表达量显著低于DP T细胞(t=7.619,P<0.01);CD4^(+)T细胞与CD8^(+)T细胞中TIPE2相对表达量比较差异无统计学意义(t=1.256,P>0.05)。WT小鼠与Tipe2^(-/-)小鼠外周血、脾脏和淋巴结中CD4^(+)T细胞百分比比较差异无统计学意义(t=0.670、0.128、0.128,P>0.05);WT小鼠与Tipe2^(-/-)小鼠外周血及脾脏和淋巴结中CD8^(+)T细胞百分比比较差异无统计学意义(t=1.488、0.542、0.255,P>0.05)。哮喘组小鼠肺泡灌洗液CD4^(+)T细胞中TIPE2相对表达量显著低于对照组(t=15.370,P<0.001);对照组与哮喘组小鼠肺泡灌洗液CD8^(+)T细胞中TIPE2相对表达量比较差异无统计学意义(t=0.132,P>0.05)。结论在T细胞的不同发育阶段TIPE2的表达水平不同;TIPE2基因缺陷对T细胞的发育过程无明显影响,可显著影响哮喘发生发展过程中CD4^(+)T细胞功能。

凡纳滨对虾ARMC8基因的克隆及表达

为了研究含Armadillo重复蛋白8在凡纳滨对虾抗病感染过程中所起的免疫作用,本实验采用RACE-PCR技术首次克隆得到凡纳滨对虾ARMC8基因(LvARMC8,Gen Bank注册号:KX058562)的c DNA序列全长,并利用在线软件进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR(Rt-PCR)技术对LvARMC8基因在凡纳滨对虾不同组织及感染白斑综合征病毒和副溶血弧菌过程中的表达变化特征进行分析。结果显示,LvARMC8基因全长为2917bp,其中开放阅读框长2046 bp,编码681个氨基酸,5′非编码区长49 bp,3′非编码区长822 bp。预测分析显示LvARMC8编码的蛋白质含有6个ARM结构域。同源性分析发现,LvARMC8基因与内华达古白蚁ARMC8基因的相似度最高,为71%。系统进化分析结果显示,LvARMC8和多种无脊椎动物ARMC8聚为一支,其中与昆虫类动物赤拟谷盗、致倦库蚊和柑橘凤蝶的亲缘关系最近。Rt-PCR分析发现,LvARMC8基因在凡纳滨对虾多个组织中均能检测出,在表皮中表达量最高,眼柄中表达量最低。WSSV感染后12 h,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量显著降低,但48 h后显著升高,72 h达到最高水平。除副溶血弧菌感染后24 h外的时间点,LvARMC8基因在凡纳滨对虾血液中的表达量均显著升高。研究表明,LvARMC8基因可能参与凡纳滨对虾抗病免疫应答途径。