GTF-PAc融合防龋DNA疫苗的研究(Ⅰ)携带GLU基因片段的真核表达质粒pGLU的构建

目的 :将变形链球菌葡糖基转移酶GTF I的编码葡聚糖结合区 (GLU)的序列克隆到真核载体 pCI中 ,为构建GTF PAc融合防龋DNA疫苗做准备。方法 :用PCR的方法扩增含gtfB基因的重组质粒 pYNB13的GLU区序列 ;将载体 pCI和GLU扩增片段分别酶切 ,体外连接 ,构建成真核表达质粒pGLU ,酶切电泳鉴定。 结果 :PCR获得了glu目的片段 ,质粒 pGLU含有 glu目的片段。 结论 :构建出了含有gtfB基因重要抗原决定簇区的真核表达质粒

基因工程龋齿疫苗菌株的构建

采用PCR技术，扩增出两端分别增添了EcoR1和BamH1酶切位点的变链菌GTF基因，将其与高效表达的质粒PBV220载体连接后，克隆到大肠杆菌中，成功地构建出一株高效表达GTF基因的菌株。该菌株培养方法简便，GTF抗原表达量高，稳定性好，抗原主要存在于细胞内部，无包涵体形成，用所提的GTF抗原免疫家兔具有明显的免疫原性．是制备龋齿疫苗较为理想的工程菌株。

依博素生物合成基因ste22的异源置换研究

目的依博素是由链霉菌产生的一种新型胞外多糖,具有显著抗类风湿性关节炎的作用,我们研究已确定了该多糖的生物合成基因簇(ste)。为了对依博素结构进行改造以提高其生物活性,对其生物合成基因ste22进行了异源置换研究。方法采用PCR扩增方法从乳酸菌获得了编码葡萄糖糖基转移酶的基因gtf,通过基因同源重组双交换,从链霉菌中置换了ste22基因。采用白细胞介素-1合成酶活性测定方法及小鼠巴豆油急性炎症模型,初步确定了基因置换株的依博素衍生物生物活性。结果获得了葡萄糖糖基转移酶基因置换株Streptomyces sp.139(gtf-22),产生了依博素新衍生物EPS-22g。研究表明该衍生物与依博素相比,葡萄糖比例从2.14%显著上升到48.64%,体外活性实验显示,其对炎症细胞因子白细胞介素-1合成关键酶ICE抑制率高于依博素,小鼠巴豆油急性炎症体内活性分析结果证明,该衍生物抑制活性亦高于依博素。结论采用异源基因置换生物合成基因的方法改造依博素产生菌,可能是获得生物活性较好新多糖衍生物的一种有效手段。

葡萄糖基氟虫腈处理下蓖麻内参基因的稳定性分析

【目的】筛选葡萄糖基氟虫腈（GTF）及溶剂二甲基亚砜（DMSO）处理下蓖麻Ricinus communis稳定的内参基因,为研究GTF的韧皮部装载机制提供参考。【方法】选取Actin,ARC,ef1a,Sam DC,TUA6为内参基因,通过实时荧光定量PCR分析基因表达量并利用ge Norm,Norm Finder,Best Keeper,Delta CT软件及Ref Finder在线分析工具综合比较不同时间和不同浓度的GTF与DMSO处理后,5个候选内参基因在蓖麻幼苗子叶中表达的稳定性。【结果】各软件分析得出的内参基因稳定性排名依次为ge Norm：Actin=ef1a〉Sam DC〉ARC〉TUA6;Norm Finder：Sam DC〉ARC〉Actin〉ef1a〉TUA6;Best Keeper：Actin〉ef1a〉Sam DC〉ARC〉TUA6;Delta CT：Sam DC〉Actin〉ARC〉ef1a〉TUA6;Ref Finder：Actin〉Sam DC〉ef1a〉ARC〉TUA6,而单独分析DMSO处理时,稳定性排名则为：ef1a〉Sam DC〉Actin〉TUA6〉ARC。【结论】综合分析GTF和DMSO处理,Actin的表达最稳定;在DMSO处理下,则ef1a最为稳定。