生长激素促分泌素受体基因敲除小鼠胚胎干细胞的建立

目的建立生长激素促分泌素受体(ghrelin receptor,GHS-R)基因敲除小鼠胚胎干细胞(ES细胞)杂合子模型,为研究GHS-R基因的功能奠定基础。方法用TK-neo置换原X-pPNT载体的PGK-neo构建目标载体。以小鼠基因组DNA为模板,用PCR方法扩增2条同源臂,将其按照一定方向装入含有TK-neo的X-pPNT载体,并测序鉴定。载体线性化及纯化后电穿孔转染小鼠ES细胞,用G418和更昔洛韦(Gancyclovir)对电穿孔转染后的ES细胞进行正、负筛选培养,得到双药抗性ES细胞,克隆后抽提基因组DNA,分别用PCR方法鉴定2条同源臂,并测序确定成功同源重组的ES细胞克隆。结果改建X-pPNT载体成功,PCR获得2条同源臂片段,测序正确,并按一定方向装入打靶载体,ES细胞转染后经双药筛选得到328个阳性ES细胞克隆,PCR及测序鉴定证实3个克隆发生同源重组。结论本研究成功获得了GHS-R(-/+)杂合子小鼠ES细胞克隆,为进一步通过显微注射及杂交育种获得GHS-R基因敲除小鼠打下了基础。

“基因敲除”研究进展

本文概述了基因敲除技术的原理及研究进展,尤其对条件性基因敲除进行了系统性的详细介绍,并简述了其在动物发育和基因表达机制研究中的重要意义.

敲除PKD1基因的小鼠胚胎干细胞的建立(英文)

目的 :通过 PK D1基因打靶载体的胚胎干细胞转染、药物筛选以及分子鉴定 ,获得发生同源重组的胚胎干细胞克隆 ,为产生 PK D 1基因缺陷小鼠品系准备条件。 方法 :体外培养小鼠胚胎干细胞 ,用电穿孔的方法进行 PK D1基因打靶载体的转移 ,并用 G4 18进行筛选培养 ,得到阳性克隆后 ,进一步扩大培养 ,抽提胚胎干细胞的基因组 DNA ,采用 DNA印迹法进行分子鉴定。结果 :经 G4 18筛选培养得到 192个阳性克隆 ,分子鉴定获得 2个发生同源重组的胚胎干细胞克隆。结论 :鉴定得到的 2个同源重组胚胎干细胞克隆 ,为进一步建立 PK

CREG基因敲除小鼠胚胎干细胞的筛选及鉴定

目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)在发育过程中的作用,本研究拟通过高浓度药物筛选获得基因敲除的小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)。方法:用0.5 mg/ml、1.0 mg/ml、1.5 mg/ml、2.0mg/ml、2.5 mg/ml及3.0 mg/ml 6个浓度的G418培养CREG杂合型(CREG其中一个等位基因被新霉素抗性neo基因替代)小鼠ESC 2周,确定最佳的G418筛选浓度。挑取该浓度下存活的ESC克隆进行扩增。将每个ESC克隆一半冻存,另一半贴壁培养。待ESC生长至80%融合后分别提取基因组DNA和蛋白。PCR方法扩增CREG基因明确基因组中是否存在CREG基因,WesternBlot方法鉴定是否有CREG蛋白表达。结果:确定2.0 mg/ml G418为最佳的筛选浓度。在该浓度下,共获得存活的克隆10个,PCR证实C2及C7克隆基因组中没有CREG基因,Western Blot证实C2及C7无CREG蛋白表达。结论:成功获得CREG基因敲除的小鼠ESC 2株,为深入研究CREG功能奠定了基础。