志贺氏菌毒力相关因子研究现状

志贺氏菌的毒力因子主要存在于毒性大质粒上,染色体上则主要存在一些毒力调控因子以辅助质粒毒力因子的表达.近年来志贺氏菌的研究主要集中在对其毒力基因功能的解读与阐释.就志贺氏菌毒性大质粒和染色体上的毒力相关基因及其功能研究进展进行综述.

宋内志贺氏菌粗糙形体菌株的研究

本研究证明,宋内志贺氏菌除菌落形态光滑的Ⅰ相(D_Ⅰ)和粗糙的Ⅱ相(D_Ⅰ)外,尚有菌落形态粗糙、与Ⅱ相及Ⅰ相血清均凝集、并具有致病力的第三种形体。为了与具有致病力、仅Ⅰ相血清凝集的Ⅰ相(D_Ⅰ)和无致病力、仅Ⅱ相血清凝集的Ⅱ相(D_Ⅱ)区分,建议将这种形体按 Ewing 等的描述用ⅠⅡ相(D_(ⅠⅡ))表示。

应用基因探针检测志贺氏菌属毒力株的研究

本文应用α^(-32)P标记的福氏5型140Md侵袭性质粒之ECORI 17kb基因探针杂交、侵袭性质粒分析和豚鼠角膜炎试验对志贺氏菌属的毒力株进行了研究。结果表明,健康人菌株探针杂交的弱阳性率(47.18％)和阴性率(5.33％)均高于病人菌株(8.27％,1.38％),(u=14.03 p<0.01;u=3.644p<0.01),提示,无症状带菌者多因弱毒株或无毒株感染所致。探针杂交的阴性菌株和90％以上的弱阳性菌株均属于3a、1b、2a、4a和DⅡ5个血清型,表明这些血清型中的弱毒株、无毒株或丧失质粒的频率较高。

萧山区2007年-2010年宋内志贺菌的病原分子生物学特征

目的:了解2007年-2010年萧山区分离的宋内志贺菌的病原分子生物学特征,并分析其流行规律。方法:对130株宋内志贺菌进行生化反应和血清分型鉴定,利用PCR方法检测侵袭性质粒抗原H(ipaH)基因。使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)进行同源性分型分析,并使用BioNumerics进行聚类分析以确定菌株间的亲缘关系。结果:130株菌株均为宋内志贺菌,均具有ipaH基因。PFGE分型将菌株分成90个型别,相似性72.4%～97.9%,主要分为A、B、C三个克隆群。结论:PFGE分型结果表明2007年-2010年萧山区的宋内志贺菌来源具有多样性,A、B、C三个克隆群的菌株占据主导地位,应引起重视。

福氏2a痢疾杆菌侵袭相关基因的克隆与表达

以福氏2a 痢疾杆菌大质粒为材料,粘粒(cosmid)为载体构建大质粒基因库。用探针菌落原位杂交,质粒分析及酶切、Southern blot、Western blot 等方法进行鉴定。获得了四株表达侵袭相关蛋白的克隆株,而且它们表达出与侵袭活性密切相关的接触性溶血活性。

小肠结肠耶氏菌毒性质粒基因文库的构建

本研究以pAT153质粒为载体,构建了小肠结肠耶氏菌毒性质粒(pVYE)经限制性内切酶Bam HI和PstI消化产生的DNA片段的基因文库.实验克隆了8株(pYBI～8)pVYE的BamHI片段和6株(pYPI～6)pVYE的PstI片段的重组子.其中pYB4、pYB7、pYB8重组质粒中插入的pVYE—Bam HIDNA片段的分子量分别为8.7、3.8、20kb;pYP3、pYP5、pYP6重组质粒中插入的pVYE-Pst I DNA片段的分子量分别为4.5、3.0、7.0kb.本实验结果为进一步筛选和制备特异性基因探针奠定了基础.

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测志贺氏菌

【目的】将环介导等温扩增技术（LAMP）与横向流动试纸条（LFD）联合应用,建立一种可应用于志贺氏菌快速检测的LAMP-LFD技术。【方法】以福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原H（ipa H）基因为检测靶标设计3对特异性引物（其中上游内引物Sfl-ipa H-FIP由生物素标记）,进行LAMP反应;同时设计1条异硫氰酸荧光素（FITC）标记的探针Sfl-ipa H-HP,与获得的LAMP产物进行特异性杂交,杂交产物经LFD完成检测。【结果】优化后的LAMP反应条件为63℃ 40 min,加上LFD结果判读共需50 min。LAMP-LFD方法能够特异性检测出福氏志贺氏菌,而对肠炎沙门氏菌等其它4种导致腹泻的致病菌和创伤弧菌等5种常见食物源性致病菌,以及4株不同大肠杆菌的检测结果呈阴性。该方法针对福氏志贺氏菌的检测灵敏度为1.0×10^2 CFU/m L或4 CFU/反应,针对人工污染鲤鱼肠组织的检测灵敏度是5.0×10^2 CFU/m L,是以LAMP外引物Sfl-ipa H-F3/Sfl-ipa H-B3的常规PCR方法的100倍。【结论】建立的LAMP-LFD技术具有操作简单、检测快速准确、检测成本低等优点,有望在志贺氏菌的常规监测和即时检测中被普及使用。

肠炎沙门菌spvD基因缺失与回补株的构建及其对Caco-2细胞毒力的研究

目的探讨肠炎沙门菌spvD基因对人克隆结肠腺癌Caco-2细胞侵袭力及胞内增殖力的影响。方法利用自杀质粒介导的同源重组技术构建spvD基因缺失株,PCR扩增并克隆spvD基因于pBAD33表达载体获得回补质粒,导入相应缺失株得到回补株,并将pBAD33导入野生株及缺失株作为空载对照。荧光定量反转录聚合酶链式反应检测spvD mRNA表达水平。以Caco-2细胞作为体外模拟人肠上皮细胞模型,分别将野生株、缺失株及回补株与其共培养,探究spvD基因对Caco-2细胞的毒力。使用LSD-t检验进行3组间spvD mRNA表达水平比较及胞内活菌数比较,使用χ^(2)检验进行3组间侵袭率的比较。结果以野生株spvD mRNA表达量作为单位“1”,缺失株为“0.00”、回补株为“2.60”(LSD-t野生株,缺失株=1.11,P=0.31;LSD-t_(野生株,回补株)=-1.77,P=0.13;LSD-t_(缺失株,回补株)=-2.88,P=0.03),该结果证实了缺失株及回补株的成功构建。上述3组肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭实验结果显示,野生株侵袭率为0.23%,缺失株侵袭率为0.16%,回补株侵袭率为0.16%,差异无统计学意义(χ^(2)=1.13,P=0.570)。通过比较细菌干预Caco-2细胞后不同时间点胞内活菌数,发现在干预16 h时,野生株(6.50×10^(6) CFU/ml)、回补株(7.25×10^(6) CFU/ml)胞内活菌数明显增多,均高于缺失株(1.90×10^(6) CFU/ml)(LSD-t野生株,缺失株=7.95,P=0.00;LSD-t_(野生株,回补株)=-1.27,P=0.25;LSD-t_(缺失株,回补株)=-9.22,P=0.00)。结论尚不能认为spvD基因影响肠炎沙门菌对Caco-2细胞的侵袭力,但该基因可促进肠炎沙门菌在Caco-2细胞内增殖。