基因打靶技术的研究进展

基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞(ES细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的试验手段,具有广阔的应用前景。对基因打靶技术原理、步骤、条件性基因打靶以及应用进行综述。

Rtn4-A/B基因敲除小鼠模型的制备

目的通过制备Rtn4-A/B基因敲除小鼠,探索Rtn4-B基因的生物学功能。方法用细菌人工染色体(BAC)载体构建Rtn4-A/B基因打靶载体并使其线性化,通过电转化法将其转入129SvEv品系雄性小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)。将正确同源重组的ES细胞注射入C57BL/6J小鼠囊胚腔,繁育出嵌合体小鼠后,进一步繁殖以获得杂合子小鼠。抽提小鼠尾尖组织DNA,采用PCR法鉴定小鼠的基因型。结果基因打靶后,得到14个发生双臂正确同源重组ES细胞克隆。利用阳性ES细胞克隆进行囊胚内显微注射,得到5只嵌合率大于50%的雄鼠,最终繁育得到4只Rtn4-A+/-B+/-杂合子小鼠。结论利用ES细胞基因打靶、同源重组等方法,成功获得Rtn4-A/B基因敲除杂合子小鼠。

微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠的制备和鉴定

目的制备微小RNA簇miR-302s条件性基因打靶小鼠。方法构建miR-302s打靶载体，通过电穿孔的方法转染胚胎干细胞（ES细胞），用正负筛选法筛选阳性Es细胞并进行PCR鉴定和Southern分析。利用显微注射技术将正确同源重组的ES细胞注射至B6（Cg）-Tyr〈sup〉c．2J〈／sup〉／J小鼠囊胚腔内，注射后的囊胚植入受体小鼠子宫。将得到的嵌合体小鼠与野生型雌鼠交配获得miR-302s-LoxP基因打靶小鼠。结果获得嵌合体小鼠11只，其中4只嵌合雄鼠嵌合率〉50％。利用嵌合体小鼠进行繁育交配，得到miR-302s基因打靶杂合子小鼠11只。结论成功建立miR-302s条件性基因打靶小鼠模型，为进一步研究miR-302s基因功能打下基础。

“三腿一平台”组成的“基因打靶”——评介2007年度诺贝尔医学奖

2007年度诺贝尔医学奖项目——基因打靶,由三腿和一个平台所构成。三条腿分别是转基因学、同源重组和胚胎干细胞,一个平台指的是基因敲除。除了评价这些组成部分以外,还对推迟评奖进行了质疑。

介绍一种鉴定胚胎干细胞基因打靶快速、经济的筛选新方法(英文)

小鼠基因剔除动物模型越来越广泛地应用于哺乳动物基因功能与疾病的研究。然而每当胚胎于细胞同源重组的效率过低时,鉴定与分离带有定位变异的阳性克隆就会既费力又昂贵。本工作以类固醇受体共激活子基因为例,研究出一种快速鉴定阳性克隆的新方法。在构造重组载体时,将一段编码半乳糖苷酶的DNA序列整合到共激活子基因的蛋白起始码后面。于是,在干细胞内同源重组发生以后,半乳糖苷酶的表达就会受控于内源性共激活子基因的启动子。在载体与半乳糖苷酶DNA随机整合的大多数非特异克隆中,因为缺少启动子或由于不正确的氨基酸编码连接,导致合成牛乳糖苷酶的可能性较小。因此,在半乳糖苷酶染色阳性的克隆中,具有特异突变的阳性克隆可以富集30倍以上。从牛乳糖苷酶的阳性克隆中,再用Southern Blot方法进一步确认带有基因剔除的阳性克隆就大大减少了工作量。因为半乳糖苷酶的细胞化学染色法简便而可靠,所以在重组效率低时,可以用这种方法在短期内筛选大量克隆。但是应该注意,应用该方法的前提条件是所研究的基因必须在胚胎干细胞内表达。这种方法更为重要的意义在于当带有基因剔除的胚胎干细胞发育成小鼠后,牛乳糖苷酶的组化染色法可以轻而易举地用来揭示所研究基因在动物不同组织与细胞中的表达水平。

基因打靶技术的研究进展

基因打靶在人类遗传病动物模型的构建、基因治疗和基因功能研究等方面都有重要的作用。本文综述了一些常用的基因打靶策略 。

基因打靶技术及其研究进展

简要阐述了基因打靶的概念和基本环节 ,系统介绍了筛选方法和基因打靶的策略。基因打靶在基因功能研究、家畜遗传改良、人类疾病动物模型的建立和基因治疗等方面有着广阔的应用前景。

基因打靶技术的应用研究

简要阐述了基因打靶的概念和基本环节 ,系统介绍了筛选方法和基因打靶的策略。基因打靶在基因功能研究、家畜遗传改良。

基因敲除小鼠技术的研究进展

基因敲除小鼠技术的建立和发展使得人们为研究基因的功能和寻找新的治疗人类疾病的靶点提供了强有力的支持。基因打靶和基因捕获是两种通过胚胎干细胞(Embryonicstemcell,ESC)构建基因敲除小鼠的技术。基因打靶通过同源重组替换内源基因从而敲除目的基因,而基因捕获则有启动子捕获和polyA捕获两种方法对目的基因进行敲除。近年来,有许多新的基因敲除技术不断被开发出来,包括Cre/loxP系统、CRISP/Cas9系统以及最新的ZFN技术和TAILEN技术,都有望取代传统基因敲除手段。文中简要阐述了如今新出现的几种基因敲除小鼠技术。