禽流感H5亚型HA基因在COS-7细胞中的瞬时表达与检测

检测构建于真核表达载体PCI上的禽流感H5亚型(H5N1)HA基因的基因转染效率及瞬时表达,为基因疫苗的体外表达提供依据。在体外扩增并酶切鉴定PCIHA质粒;常规方法培养COS-7细胞;质粒与脂质体按照不同的比例混合,以脂质体介导法转染PCIHA,应用荧光显微镜观察转染效率及瞬时表达情况。结果表明转染效率与质粒和脂质体的比例有关,基因转染在24h后开始表达,48～72h表达量最高。本试验通过以脂质体不同剂量的优化方法转染COS-7细胞,获得了较高效率的表达,证实了AIV HA基因DNA疫苗可在体外表达。

绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞

目的建立以增强型绿色荧光蛋白基因示踪骨髓间质干细胞的方法.方法采用密度梯度离心法分离、培养兔骨髓间质干细胞,以脂质体介导法转染增强型绿色荧光蛋白基因的表达质粒,荧光显微镜观察基因表达及转染效率.结果绿色荧光蛋白在基因转染12 h后开始表达,48～72 h达高峰,并在1周内有较强的表达,以后逐渐减弱,4周左右仍有少量表达,转染效率与质粒、脂质体的浓度有关,外缘基因导入后不影响骨髓间质干细胞的生长和增殖.结论脂质体介导的绿色荧光蛋白基因转染骨髓间质干细胞后能安全、有效地表达,转染效率为20%～30%,是一种较为理想的干细胞示踪方法.

转染p16、p53对白血病细胞株K562及HL-60的抑制作用

本研究构建p53,p16基因真核表达载体,用脂质体法转染入白血病细胞,观察其在白血病细胞中的表达和对白血病细胞的作用。设计并构建包含野生型p53cDNA与p16cDNA的真核双表达载体pBudCE4.1-53-16,用脂质体法转染白血病细胞,用间接免疫细胞化学法、Western blot法检测鉴定外源性p53及p16的表达情况。通过CCK-8,流式细胞仪检测细胞的生长曲线、细胞周期、细胞凋亡。结果发现:p53p16基因双表达真核载体构建成功,体外转染入白血病细胞后能检测到外源性P53、P16蛋白在白血病细胞中表达。转染48小时后,试验组与对照组比较,细胞周期阻滞(p<0.001);试验组和对照组比较,细胞增殖下降,细胞凋亡增加(p<0.001)。结论:重组质粒pBudCE4.1-53-16构建成功,经体外转染白细胞细胞后2个目的基因能够在细胞中同时表达,并引起细胞周期阻滞于G0期,细胞凋亡增加。

晚期糖基化终末产物对内皮细胞前列腺素合成的影响及可能机制

目的探讨晚期糖基化终末产物对内皮细胞前列环素、前列腺素E2合成的影响及可能机制。方法不同浓度的晚期糖基化终末产物作用内皮细胞,酶联免疫吸附法测定前列环素的稳定代谢产物6-酮—前列腺素F1α和前列腺素E2的表达。逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学测定环氧合酶2 mRNA和蛋白表达的改变。晚期糖基化终末产物受体、核因子κB单/双基因反义RNA对晚期糖基化终末产物刺激内皮细胞分泌6-酮—前列腺素F1α、前列腺素E2的影响。结果晚期糖基化终末产物引起内皮细胞分泌6-酮—前列腺素F1α、前列腺素E2增加(P<0.01),具有剂量依赖关系。晚期糖基化终末产物引起内皮细胞环氧合酶2的mRNA和蛋白表达增加(P<0.01)。晚期糖基化终末产物受体、核因子κB单/双基因反义RNA可减轻晚期糖基化终末产物刺激的内皮细胞分泌6-酮—前列腺素F1α、前列腺素E2(P<0.05或0.01),双基因的抑制效果更明显(P<0.05)。结论晚期糖基化终末产物可能通过晚期糖基化终末产物受体、核因子κB途径使内皮细胞的环氧合酶2表达增加,从而引起前列环素、前列腺素E2合成增加,这个机制可能参与了晚期糖基化终末产物所致的血管炎症损伤。

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的制备多聚胺阳离子脂质体(PolyamineCationicliposome,PCL),转染哺乳动物细胞,评估其转染效率及细胞毒性,筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以一定比例,制备PCL,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞毒性,筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4∶1时可达到高效低毒,转染后48h转染效率最高。结论由TC-Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率,在一定条件下可达到相对高效低毒,为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。

腺病毒5型E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响

目的探讨E1A基因对乳腺癌细胞化疗药敏感性的影响。方法双酶切质粒pUC119-E1A,获得E1A基因,连接入pEGFP-C1载体,构建真核表达质粒pEGFP-E1A。经脂质体介导转染人乳腺癌细胞系SK-BR-3细胞株,经筛选获得稳定表达E1A基因的转染细胞。RT-PCR检测E1A基因的mRNA转录水平。体外观察各组细胞软琼脂集落及对抗肿瘤药物顺铂的敏感性。结果RT-PCR结果显示,只有重组质粒pEGFP-E1A转染的细胞在约380 bp处有一特异性扩增条带,与未转染组和空载体转染组相比,转染E1A基因后,SK-BR-3肿瘤细胞在软琼脂中形成的集落明显变小,集落形成率明显降低,对顺铂的敏感性明显提高。结论已成功构建E1A基因表达质粒,并稳定表达了E1A基因,表达产物明显抑制乳腺癌细胞的生长,有效提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,为其临床应用提供了理论和实验依据。

多药耐药基因转染人骨髓间充质干细胞及对其化疗保护作用的实验研究

目的探讨逆转录病毒介导多药耐药基因(mdr1)体外转染人骨髓间充质干细胞(MSCs)能否提高其对化疗药物的耐受性。方法采用percoll密度梯度离心法自骨髓中分离MSC并进行纯化和扩增;脂质体转染法将携带有mdr1基因的逆转录病毒载体导入293T包装细胞,获得的病毒上清感染MSC,流式细胞术测定mdr1基因编码产物P-糖蛋白(P-g170)的表达水平;罗丹明(Rh123)排泌试验检测P-g170的功能活性;MTT法测定转染MSC对化疗药物耐受性。结果mdr1基因导入骨髓MSC后稳定表达P-g170的阳性细胞百分率为33.9%,对照组为0.7%;Rh123排泌试验证实P-g170具有功能活性;转染MSC对多种化疗药物的耐受性明显强于未转染MSC。结论mdr1基因体外转染人骨髓MSC可明显提高MSC对多种化疗药物的耐受性,为有效提高大剂量化疗在肿瘤治疗中的应用提供了有力依据。

转FAS基因治疗膀胱癌的实验研究

目的探讨Fas基因转染对膀胱癌细胞的作用。方法应用脂质体介导的方法,将人Fas cDNA导入膀胱癌细胞EJ中,并利用Northem bolt、原位杂交、流式细胞术检测细胞的Fas mRNA和分子表达。以顺铂作用转染前后的EJ细胞,用流式细胞仪、DNA梯形带和NTT法分析顺铂对转染前后的EJ细胞抑制增殖和诱导凋亡的能力。结果脂质体介导的Fas基因转染可明显增强膀胱癌细胞EJ的Fas表达,顺铂对转染后的EJ细胞抑制细胞增殖和诱导凋亡的能力明显增强。结论 Fas系统参与泌尿生殖系肿瘤的发生发展过程,Fas基因转染可显著上调膀胱癌细胞EJ的Fas表达。联合应用Fas基因转染和顺铂可获得协同的细胞毒作用,为进一步将Fas基因用于临床治疗膀胱癌提供了理论与实验基础。

骨形态发生蛋白2基因转染对舌鳞癌细胞体内外生物学行为的影响

目的探讨骨形态发生蛋白2(BMP2)基因转染对体外舌鳞癌细胞的作用及机制,并观察体内转染BMP2基因对严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠皮下移植瘤生长与转移的影响。方法体外培养舌癌Tca8113细胞,将重组腺病毒介导的BMP2(Ad-BMP2)基因分别按0、50、100感染复数(MOI)转染Tca8113细胞后,采用Western blot检测Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5表达的差异。建立SCID鼠肿瘤模型并瘤内注射Ad-BMP2基因,观察肿瘤体积的变化及肿瘤转移情况。结果 Ad-BMP2基因成功转染至Tca8113细胞,MOI为100时转染效率较高,Ad-BMP2组和PBS组细胞中BMP2、Smad1和Smad5的表达差异有统计学意义,P<0.05,Ad-BMP2组Smad1和Smad5的表达量与BMP2的浓度呈正比。SCID鼠皮下移植瘤的体积在2周后平均增大0.6 cm3,瘤内注射Ad-BMP2基因后,明显抑制移植瘤的生长。肝、脾、肾、大网膜等脏器均未查见肿瘤转移。结论以腺病毒为载体的BMP2在Tca8113细胞中有效表达,Smad1和Smad5蛋白的表达也显著提高。基因转染BMP2显著抑制SCID鼠舌癌移植瘤的生长。