伊马替尼对K562细胞内SHIP基因表达的影响及促凋亡作用

目的:观察甲磺酸伊马替尼干预K562细胞后SHIP、caspase-1、caspase-3、caspase-9及bcl-2基因表达的变化,初步探讨伊马替尼促凋亡的作用途径。方法:将不同浓度甲磺酸伊马替尼与K562细胞在体外共培养,于不同时段留取标本,采用实时定量PCR方法检测SHIP基因表达水平的变化,并用半定量逆转录PCR方法检测抗凋亡基因bcl-2及促凋亡基因caspase-1、caspase-3、caspase-9表达水平的变化,用MTT法观察伊替尼对细胞增殖的抑制作用,用膜联蛋白Ⅴ/碘化丙锭(AnnexinⅤ/PI)双标记法分析细胞凋亡。结果:甲磺酸伊马替尼可使K562细胞内SHIP基因表达水平升高,且与剂量和作用时间有关;caspase-9表达水平亦升高并与SHIP基因表达水平有直线相关关系;而caspase-1、caspase-3和bcl-2表达水平无显著变化;伊马替尼可使细胞增殖率降低、凋亡率增加,并可见到明显的形态学变化。结论:甲磺酸伊马替尼可使K562细胞内SHIP及caspase-9基因表达水平升高且可促进细胞凋亡,其促凋亡作用机制可能与上调SHIP和caspase-9基因表达有关。

外源性SHIP基因对K562细胞周期及其相关蛋白表达的影响

目的:探讨SHIP基因对人白血病细胞系K562细胞周期的调控作用。方法:用携带野生型SHIP基因及绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的慢病毒及空载体慢病毒转染人白血病K562细胞。FCM检测转染效率、细胞凋亡率及细胞周期变化,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RFQ-PCR)检测SHIPmRNA水平的变化,Western印迹法检测SHIP、cyclinD1、p21WAF1/CIPI、p27KIP1蛋白表达水平的变化。结果:与转染空载体组和未转染组相比,转染野生型SHIP基因的K562细胞增殖减慢,凋亡率明显上升(P<0.05);细胞周期显示,G0/G1期延长,G1期前出现亚二倍体的凋亡峰,S期和G2/M期比例降低;cyclin D1表达降低,p21WAF1/CIPI和p27KIP1表达增加。结论:转染野生型SHIP基因可使细胞周期阻滞在G0/G1期,抑制白血病细胞增殖,促进白血病细胞凋亡。

急性白血病细胞SHIP基因的突变分析(英文)

SHIP (SH2domaincontaininginositol5′ phosphatase)基因主要在造血细胞表达 ,并在造血细胞的发生发育中发挥关键的负调节作用。本研究旨在评价SHIP基因突变在白血病发病中的作用。利用RT PCR、SSCP及DNA序列分析技术检测了 32例急性髓细胞白血病、9例急性淋巴细胞白血病及正常对照骨髓或外周血标本中SHIP基因表达及突变情况。RT PCR显示所有标本中都有SHIP基因表达 ,2 2 % (7/32 )AML和 12 % (1/9)ALL标本中存在SHIP基因的突变 ,其中 1例AML患者发病时标本同时存在 2个错义突变 ,而完全缓解 (CR)后消失 ,而且其发病时的白血病细胞在体外随着IL 3的刺激其Akt的磷酸化明显增加。结论 :本研究首次发现急性白血病细胞中SHIP基因突变 ,提示SHIP基因的突变可能与白血病发病有关 ;在造血细胞中 ,它很可能做为一个抑癌基因通过负性调节PI3K/Akt信号通路发挥作用。

SHIP2基因与2型糖尿病

2型糖尿病主要特征是胰岛素分泌异常和胰岛素抵抗,环境因素和遗传因素交互作用共同促成了糖尿病的发生。研究发现多种基因参与糖尿病的发生,最近发现SHIP2基因与胰岛素抵抗及2型糖尿病相关,该基因可抑制胰岛素分泌、降低机体对胰岛素的敏感性,研究也表明当该基因不起作用时,胰岛素分泌就会失控,可导致严重的低血糖发生,因此,SHIP2基因可成为2型糖尿病的一个重要的治疗靶点。

慢病毒载体介导SHIP基因抑制K562细胞增殖及对PI3K/Akt信号通路的调控

背景与目的:SHIP基因主要表达于造血细胞,通过降解PIP3抑制PI3K/Akt信号通路而在造血细胞增殖和存活中起重要负调控作用。本研究通过慢病毒载体介导SHIP基因转染K562细胞,探讨SHIP基因改变及功能丢失与白血病发病的关系。方法:将携带SHIP基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR法检测SHIP转录水平,Westernblot法检测转染后SHIP蛋白表达及Akt磷酸化水平的变化;比较SHIP基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果:K562细胞中SHIP蛋白阴性。以携带SHIP基因的慢病毒载体转染K562细胞后,细胞增殖抑制率升高,K562-wtSHIP-FIV-G细胞的增殖抑制率由转染第3天的(9.9±1.5)%升到第5天的(40.6±2.3)%;伴有Akt磷酸化水平明显减弱;转染后,K562-wtSHIP-FIV-G组细胞p-Akt的表达水平由0.533降低到0.245(P<0.01),细胞增殖明显被抑制。此外,SHIP蛋白还能使K562细胞出现凋亡特征,Hoechst33342染色结果转染wtSHIP基因组K562细胞第5天早期凋亡率[(38.3±4.3)%]明显高于K562-FIV-G组细胞[(8.2±0.9)%]和未转染组K562细胞[(7.7±0.8)%]。结论:SHIP基因具有重要的抑制细胞增殖和促进凋亡的能力,SHIP基因缺失导致K562细胞PI3K/Akt信号途径失调,促进K562细胞增殖。

SHIP1基因过表达非小细胞肺癌细胞系的建立及其对细胞增殖能力的影响

目的:观察SHIP1对NSCLC细胞增殖的影响。方法:由NCBI Gene数据库查询获得人SHIP1基因CDS区,插至载体p TSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-EGFP,构建SHIP1真核过表达质粒;进一步利用其构建SHIP1过表达慢病毒。用该慢病毒感染A549、SPCA-1和PC-9细胞株,获得SHIP1稳定过表达NSCLC细胞系。Western blotting和q RT-PCR分别从蛋白水平和m RNA水平检测SHIP1的表达变化。采用MTT法和克隆形成实验检测过表达SHIP1的PC-9细胞增殖活力和克隆形成能力。Western blotting检测AP-1蛋白复合体各组分的表达。结果:SHIP1真核过表达质粒经测序证实构建成功。稳定过表达SHIP1的A549、SPCA-1和PC-9细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光。与阴性对照组比较,细胞中SHIP1在m RNA(P<0.01)及蛋白水平均明显升高。在PC-9细胞中,过表达SHIP1使细胞增殖、克隆形成能力降低(均P<0.01),p-c-Jun、Fos B等表达降低。结论:成功构建了稳定过表达SHIP1的A549、SPCA-1和PC-9细胞模型;过表达SHIP1可通过抑制AP-1家族蛋白抑制NSCLC细胞增殖能力。

急性白血病细胞SHIP基因的突变分析

目的 评价SHIP基因突变在白血病发病中的作用。方法 利用逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)、单链构象多态性 (SSCP)及DNA序列分析技术检测了 4 1例急性白血病患者、5 0名正常人的骨髓或外周血标本、8株白血病细胞系SHIP基因表达及突变情况。结果 RT PCR显示所有标本中都有SHIP基因表达 ,发现 32例急性髓系白血病 (AML)患者中有 7例 (2 2 % )和 9例急性淋巴细胞白血病 (ALL)患者中有 1例 (12 % )存在SHIP基因的突变 ,其中 1例AML患者发病时标本同时存在 2个错义突变 ,而完全缓解后消失。发病时患者的白血病细胞在体外随着IL 3的刺激其Akt磷酸化明显增加。结论 首次发现急性白血病细胞中SHIP基因突变 ,提示SHIP基因的突变可能与白血病发病有关 ,在造血细胞中 。

SHIP基因诱导白血病细胞株K562凋亡及其机制

肌醇5'磷酸酶(src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase,SHIP)是继PTEN之后发现的又一肌醇磷酸酶,对造血细胞增殖有关键负调控作用。目前国内外对SHIP基因与人类肿瘤抑制关系方面的研究报道较少。本研究利用携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体稳定感染K562细胞,应用实时荧光PCR、Western blot检测转染前后细胞内SHIP基因mRNA和蛋白水平的变化,MTT测定细胞增殖水平的变化,ELISA检测相关激酶活性,TUNEL、Hoechst33342检测细胞凋亡的变化,从而探讨SHIP基因诱导K562凋亡的机制,分析SHIP基因在白血病发病中的意义。结果如下:(1)K562细胞SHIP蛋白表达阴性;(2)携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体转染使K562细胞表达SHIP mRNA和蛋白;(3)与对照组相比,转染野生型SHIP基因导致K562细胞生长受抑,并出现明显的凋亡征象;(4)转染SHIP基因的K562细胞Akt磷酸化水平降低;NF-κB和bcl-xL表达降低;同时细胞促凋亡基因bad、p27表达和caspase-9、caspase-3活性明显增高。上述结果提示SHIP通过抑制PI3K/Akt路径中Akt的磷酸化,促进其下游bad、p27表达和caspase-9、caspase-3的活化,抑制bcl-xL,最终诱导白血病细胞凋亡;另外,NF-κB表达下调也是SHIP抑制白血病细胞增殖并促进细胞凋亡的重要作用机制。

SHIP基因突变对白血病细胞系K562细胞迁移及侵袭的影响

目的 研究含SH2结构域的肌醇磷酸酶（SHIP）基因碳末端PxxP结构域点突变对细胞体外迁移及侵袭能力的影响及其机制.方法 采用基因转染技术将携带野生型（wt）和突变型（mu）SHIP基因的慢病毒载体感染人白血病细胞系K562细胞；采用实时荧光定量PCR（FQ-PCR）和Western blot法分别在mRNA和蛋白水平检测转染后各组SHIP基因表达水平；采用Transwell小室比较K562/wtSHIP、K562/muSHIP转染后K562细胞跨膜及侵袭能力有无差别；Westem blot法比较各组细胞基质金属蛋白酶（ MMP）-2、MMP-9和磷酸化灶性黏着斑激酶（p-FAK）的表达情况,并检测各组细胞NF-KB活性改变.结果 感染慢病毒48 h后FQ-PCR和Westemblot法检测结果显示SHIP基因在K562细胞中表达明显升高；K562/wtSHIP组细胞迁移指数为（15.8±1.4）％,明显低于K562/muSHIP组[（54.3±2.4）％]和转染空载体的细胞对照组[K562/猫免疫缺陷病（pFIV）组,（50.3±3.8）％]（P＜0.01）；K562/muSHIP组与K562/pFIV组差异无统计学意义（P＞0.05）；侵袭实验显示K562/wtSHIP组迁移到碳酸脂膜的细胞[（32±6）/视野]较K562/pFIV细胞[（78±13）/视野]和K562/muSHIP细胞[（83±16）/视野]明显减低.而K562/pFIV细胞与K562/muSHIP细胞比较,在侵袭能力上差异无统计学意义（P＞0.05）.K562/muSHIP细胞p-FAK和NF-KB表达明显高于K562/wtSHIP细胞.结论 SHIP基因碳末端PxxP结构域对于SHIP基因负调节功能有重要作用.此位点发生突变通过影响FAK蛋白磷酸化、NF-KB活化以及MMP-9的表达影响K562细胞的体外迁移和侵袭能力；SH IP基因碳末端PxxP结构域点突变可能为致病性突变,可能是白血病细胞中SHIP功能异常的原因之一.

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及其表达抑制白血病细胞增殖的实验研究

构建真核表达载体pCAG-IRES-SHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达。将SHIP逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)产物克隆入pCAG-IRES-GFP,经酶切、PCR鉴定及测序分析,构建pCAG-IRES-SHIP-GFP重组真核表达载体;采用脂质体转染法将pCAG-IRES-SHIP-GFP及空载体转入K562细胞,实时荧光定量PCR(FQ-PCR)、Westernblot方法检测转染前后K562细胞中SHIPmRNA和蛋白的表达及Akt磷酸化水平改变,MTT、流式细胞仪检测等方法观察野生型SHIP基因表达对白血病细胞K562凋亡的影响。结果显示重组后的pCAG-IRES-SHIP-GFP质粒已成功载入SHIP的全长编码基因,序列测定的结果与预期设计完全一致。荧光显微镜下可见在转染pCAG-IRES-SHIP-GFP的K562细胞中存在荧光分布。外源性SHIP基因表达能使K562细胞增殖受抑;Westernblot检测提示K562细胞Akt308和Akt473的磷酸化水平较转染前显著下调,分别为转染前的38.7%和36.8%(P<0.01)。上述结果表明基因全长3.5kb的人野生型SHIP基因真核表达载体质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP构建成功,并在K562细胞中表达;外源性SHIP基因表达能使K562细胞凋亡增加;这些改变可能与p-Akt表达下调有关。

外源性肌醇5′磷酸酶对K562细胞增殖及凋亡的影响

目的通过慢病毒载体介导外源性5′肌醇磷酸酶(SH2domain contaihing inositol5′-phosphatase,SHIP)基因转染K562细胞,探讨ship基因对K562细胞生长增殖的影响。方法以白血病细胞株K562为研究对象,将携带ship基因的慢病毒感染K562细胞,FQ-PCR方法检测ship转录水平,Western blot方法检测转染后SHIP蛋白表达变化;比较ship基因表达前后细胞增殖、形态的变化。结果FQ-PCR和Western blot结果显示,携带ship基因的慢病毒载体pReceiver-Lv31能高效转染K562细胞,阳性率(74.6±5.8)%;细胞生长曲线显示SHIP可显著抑制K562细胞生长,抑制率(35.0±3.1)%;集落形成实验显示SHIP能显著抑制K562细胞集落形成能力[K562/SHIP组集落形成率(36.7±7.1)%,K562/FIV组为(77.7±6.3)%,(P<0.05)];细胞形态观察发现凋亡增加,TUNEL法证实SHIP蛋白促进细胞凋亡。结论外源性ship基因表达抑制白血病细胞系K562的增殖活性,并促进其凋亡。

基于模糊控制与遗传算法的潜艇自动舵设计与实现

在潜艇六自由度模型的基础上 ,根据一阶二阶波浪力对于航行在近水面潜艇深度的影响 ,采用模糊控制技术和遗传算法设计了基于二级模糊控制的遗传算法调整控制参数的潜艇自动舵控制系统。通过在近水面和水下两种状态对控制器性能仿真与结果分析 ,说明该自动舵具有很好的控制效果 ,响应较快 ,静差较小 ,具有较强抗干扰能力 ,对于近水面的深度控制有稳定的控制作用。

肌醇5’磷酸酶基因突变对K562细胞周期蛋白和Akt磷酸化的影响

目的从分子水平探讨肌醇5’磷酸酶（SHIP）基因突变对人白血病细胞系K562细胞周期及其相关基因表达的影响。方法应用携带野生型和突变型SHIP及绿色荧光蛋白的慢病毒及空载体慢病毒质粒转染K562细胞，通过流式细胞术检测K562／SHIP细胞转染效率、细胞增殖指数及细胞周期变化；MTT法检测细胞增殖活性改变，实时荧光定量PCR（FQ—PCR）检测SHIPmRNA水平变化，Western blot检测各组K562细胞SHIP、细胞周期蛋白（cyclin）D1、p21^WAF1/CIPI、p27^KIP1蛋白表达水平及Akt磷酸化变化。结果野生型SHIP基因能明显抑制K562细胞增殖，并产生明显的G0／G1期阻滞[G0／G1期细胞分别为（34．2±7．8）％和（0．7±8．3）％，P〈0．01]；但SHIP基因点突变并未影响K562细胞增殖及细胞周期改变[G0／G1期细胞分别为（33．4±4．2）％和（36．3±6．7）％，P〉0．05]。Westernblot结果发现转染野生型SHIP基因后K562细胞Akt磷酸化和cyclin D1表达水平明显下降（P〈0．01），p21^WAF1/CIPI、p27^KIP1表达增高，而突变型SHIP基因对Akt磷酸化水平和细胞周期蛋白表达几乎没有影响（P〉0．05）。结论①野生型SHIP基因通过下调K562细胞Akt磷酸化水平，进而抑制其下游cyclinD1表达，上调p21^WAF1/CIPI和p27^KIP1基因表达，导致细胞周期阻滞在G0／G1期，抑制K562细胞增殖；②SHIP基因突变体（TTC→CTC，Phe→Leu）丧失了对K562细胞的增殖抑制作用，提示SHIP基因对K562细胞增殖的负调控作用有赖于其基因结构和功能正常。

基于ITS基因分析黑斑蛙裂头蚴种系发育关系

为了研究黑斑蛙裂头蚴种系发育关系,本研究利用聚合酶链式反应(PCR)对黑斑蛙裂头蚴湖南株核糖体DNA内转录间隔区(ITS)进行扩增与测序,应用ClustalX 2.0程序对序列进行比对,再利用Mega4.0程序进行NJ法绘制种系发育树,研究黑斑蛙裂头蚴与其他带科绦虫的种群遗传关系。结果显示,湖南省不同地区10个黑斑蛙裂头蚴分离株ITS序列基本一致,为1 362~1 382bp,各分离株之间ITS-1和ITS-2序列的同源性均高于95.4%和94.6%;与基因库中其他带科绦虫ITS-1和ITS-2序列的同源性均低于59.5%和56.9%。通过建立NJ系统发育树,湖南省黑斑蛙裂头蚴分离株与欧猬迭宫绦虫位于同一大分支,得到了很好的鉴定。黑斑蛙ITS序列在种内相对保守,而种间差异较大,因此ITS序列可以作为分子标记研究黑斑蛙裂头蚴种系遗传变异,从而为黑斑蛙裂头蚴的分子流行病学和群体遗传研究奠定基础。