内含子对提高转基因动物基因表达效率的影响

综述了内含子在转基因动物基因表达中的作用，对内源性内含子和异源内含子对转基因表达的影响进行分析，讨论了内含子提高转基因动物基因表达效率的三种可能机制，并指出在表达载体构建中应考虑到内含子的重要性．

经转染人骨形态发生蛋白7基因后骨髓间充质干细胞mRNA的表达

目的构建人骨形态发生蛋白7(humanbonemorphogeneticprotein7,hBMP-7)逆转录病毒载体并检测经逆转录病毒介导基因转染的兔骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,MSCs)mRNA的表达。方法构建hBMP-7逆转录病毒载体后利用脂质体介导的基因转移技术转染包装细胞PT67,制备含目的基因的重组逆转录病毒液并感染兔骨髓间充质干细胞,采用原位杂交、RT-PCR检测hBMP-7mRNA在MSCs中的表达。结果成功构建了hBMP-7逆转录病毒载体,经hBMP-7基因转染的MSCs可表达外源性BMP-7mRNA。结论采用逆转录病毒介导的方法可以将hBMP-7转染至MSCs中并表达外源性基因。

热应激对剑尾鱼HSP70家族两成员基因表达的影响

采用RT-PCR方法扩增实验动物剑尾鱼（Xiphopohorus helleri）纯系RR-B的HSP70家族两个成员的eDNA片段，并将其克隆到PMD18-T载体中测序，将测序结果与GenBank中的核苷酸序列和推导的氨基酸序列进行同源性比较。同时利用RT-PCR半定量方法研究热应激时两个成员在剑尾鱼组织中的表达。通过克隆获得了剑尾鱼的HSP70家族两个新成员的cDNA片段，两序列均包含HSP70家族的特征性签名序列和热休克蛋白的定位序列；通过对克隆片段与已发表的青锵（Oryzias latipes）等鱼类HSP70的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列同源性比较，发现核苷酸序列同源性较高，成员一和成员二分别为85％-89％和82％-99％；氨基酸序列同源性更高，成员一和成员二分别为97％-99％和93％-99％。一般条件下，两成员在剑尾鱼肝脏、脾脏、肾脏和心脏中不表达，但热应激能刺激成员一在剑尾鱼脾脏中表达，成员二在肝脏、脾脏、肾脏和心脏中强烈表达，并可能在参与热应激保护方面起更大作用。

淫羊藿总黄酮对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-肾上腺轴钙调蛋白基因表达的影响

目的从分子水平探讨肾阳虚证病理改变及淫羊藿总黄酮的作用及其机理,为开发药物的临床新用途提供理论依据。方法用大剂量外源糖皮质激素建立肾阳虚大鼠动物模型,以实时荧光定量RTPCR技术,测定各组大鼠下丘脑垂体肾上腺轴CaMmRNA的表达,以及淫羊藿总黄酮对其的影响。结果肾阳虚大鼠下丘脑、肾上腺CaMmRNA水平升高,垂体组织CaMmRNA水平没有显著变化,淫羊藿总黄酮能够降低下丘脑组织CaMmRNA水平,但对肾上腺影响不显著。结论大鼠肾阳虚证时下丘脑中CaMmRNA水平升高,淫羊藿总黄酮可使其降低。

水稻rbcS启动子控制的外源基因在转基因水稻中的特异性表达

为将不同启动子用于转基因水稻的研究,从武运粳8号水稻中克隆了Rubisco小亚基基因(rbcS)的5'上游调控区,构建了由rbcS启动子引导的GUS融合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株叶片和叶鞘内的叶肉细胞中特异性高效表达,而在茎、根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出明显的组织与细胞特异性。结果还表明,光诱导处理可明显提高rbcS启动子启动的外源基因的表达量。

p38MAPK红色荧光蛋白融合载体的构建及表达

目的构建在哺乳动物细胞中表达的p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体。方法将克隆在pcDNA3上的FLAG标记的p38MAPK亚克隆到红色荧光蛋白载体pDsRed1-N1上,随后转染HeLa细胞。在荧光显微镜下观察结果。结果重组质粒经酶切、PCR和测序证明正确无误,并在HeLa细胞中得到高量表达。融合蛋白发出的红色荧光表明p38MAPK弥散分布于细胞质中,细胞核中也有一定的分布。结论成功构建了p38MAPK红色荧光蛋白融合载体,该载体能在哺乳动物细胞中进行表达,为研究p38MAPK的细胞内定位提供了一个重要的工具。

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidaseA1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.

桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD的克隆与分析

从已构建的硬肉桃(Prunus persica L.)双久红果实SSH文库中获得4条铜锌超氧化物歧化酶(CuZnSOD)基因的ESTs,通过blast比对和电子克隆后进行了序列拼接和经RT-PCR方法,获得桃果实铜锌超氧化物歧化酶基因PpCuZnSOD全长cDNA序列(GenBank登录号:JX217743)。该基因全长665bp,包含一个459bp的ORF(120bp-578bp),编码152个氨基酸,推测蛋白分子量为15.38kDa,理论等电点为5.60。该基因具有典型的高度保守的Cu2+和Zn2+活化中心及特征信号,其氨基酸序列与其他植物的CuZnSOD具有很高的相似性。生物信息学分析结果表明,该蛋白定位于细胞质中,是非跨膜的非分泌性亲水蛋白。二级结构分析结果表明,该蛋白主要由无规则卷曲和延伸链等蛋白质二级结构元件构成,三维结构预测结果显示,PpCuZnSOD有3个转角环和8个折叠构成桶状的活性中心。系统进化分析结果表明PpCuZnSOD与小金海棠(Malus xiaojinensis)sod2同源关系最近,而与荔枝(Lichichinensis)、龙眼(Dimocarpus longan)和拟南芥(Arabidopsis trifoliate)等亲缘关系较远。QPCR结果表明,PpCuZnSOD在幼果中表达量最高,雌蕊和雄蕊次之,花瓣和叶片中表达量最少;果实成熟前后,PpCuZnSOD在硬肉芽变桃双久红果实中的表达量显著高于软肉桃川中岛白桃中的表达量,表明该基因可能在维持果实质地和硬度方面有一定作用。本研究结果为进一步研究该基因在桃果实成熟软化中的作用奠定了基础。

细胞色素P450花生四烯酸表氧化酶在人肿瘤组织及肿瘤细胞系中的特异性表达

背景与目的:细胞色素P450花生四烯酸表氧化酶(cytochrome P450 arachidonic acid epoxygenase 2J2,CYP2J2)作为花生四烯酸的新型代谢途径,在人体中的生物学及病理生理学意义还远未被认识和阐明。本研究主要探讨CYP2J2基因在人类肿瘤组织及肿瘤细胞系中的表达及其意义。方法:采用RT-PCR、Western blot和免疫组化法检测CYP2J2在130例不同类型的人癌组织及相应的癌旁正常组织,4例炎性假瘤组织以及8种常见人源肿瘤细胞系和两种非肿瘤细胞系中的表达情况。结果:CYP2J2在78%(101例)的癌组织中特异性高表达,而癌旁正常组织未能检测到CYP2J2表达,而且CYP2J2 mRNA和蛋白表达水平呈高度的相关性(r=0.613,P<0.01)。同样,免疫组化结果分析发现78%肿瘤组织中有CYP2J2表达,而癌旁正常组织及4例炎性假瘤均阴性。此外还发现CYP2J2主要在肿瘤细胞中表达,而周围的炎性细胞及间质组织均无CYP2J2表达。8种肿瘤细胞中均高表达CYP2J2,而非肿瘤细胞系则无CYP2J2表达。结论:CYP2J2在肿瘤细胞中选择性高表达,CYP2J2可能是肿瘤发生发展的一个标志物。

丙烯腈对大鼠睾丸中雄激素结合蛋白和抑制素基因表达的影响

[目的]研究丙烯腈(acrylonitrile,ACN)对大鼠睾丸中雄激素结合蛋白(Androgen Binding Protein,ABP)和抑制素基因表达的影响。[方法]SD雄性大鼠随机分为4组,1组为对照组,另3组为染毒组,剂量分别为7.5、15.0和30.0 mg/kg体重,每天腹腔注射染毒1次,每周5次,连续13周,分别于4、8和13周末分批处死,取睾丸组织50-100 mg, 加1 ml Trizol磨成匀浆,加氯仿振摇,12 000 r/min,4℃下离心,取上清液,加异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤,得到的RNA用紫外分光光度法测定其纯度,用一步法逆转录扩增(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)目的基因,用内参标进行半定量检测。[结果]ACN染毒未引起ABP和抑制素基因表达缺失。低、中剂量组睾丸中ABP和抑制素基因表达水平无明显变化。高剂量组,染毒4周后,ABP基因表达水平显著升高(P<0.05),染毒8周后下降,但与其他组无明显差异,13周后显著下降,与其他组有显著性差异(P<0.05)。高剂量组染毒4周后,抑制素基因表达水平有下降趋势,且随染毒时间延长下降显著;中、高组在染毒8周后,抑制素基因表达水平下降显著,与对照组比较差异有显著性(P<0.01)。[结论]ACN对大鼠睾丸中ABP和抑制素基因表达水平有影响,提示丙烯腈对睾丸中支持细胞可能有损伤作用。

番茄rbcS3A启动子控制的GUS融合基因在转基因水稻中的表达

为研究不同启动子用于转基因水稻,克隆了番茄Rubisco小亚基rbcS3A基因的5′上游调控区,构建了由rbcS3A启动子引导的GUS嵌合基因,并经农杆菌介导导入到水稻中。对转基因水稻植株中GUS活性的定性与定量测定结果表明,rbcS3A启动子可驱动GUS报告基因在转基因水稻植株茎和叶组织中高效表达,而在根和种子等器官中不表达或表达活性极弱,表现出一定的组织特异性。在转基因水稻中,番茄rbcS3A启动子驱动外源基因的表达不受光诱导。

大黄素对人白蛋白诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的探讨大黄素对人白蛋白诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)发生转分化的影响。方法体外培养HK-2细胞,按处理方式分为空白对照组、大黄素对照组、白蛋白诱导组、大黄素干预组4组。分别于0h、12h、24h、48h用倒置显微镜下观察其细胞形态变化,同时RT-PCR法检测各样本α-SMA、E-cadherin、FNmRNA的表达水平。结果空白对照组、大黄素对照组HK-2细胞形态为圆形,融合后呈鹅卵石样。白蛋白诱导组12、24及48h光镜下可见细胞胞体拉长变细,细胞之间间隙增大。大黄干预组12、24、48h后可见细胞形态改变与白蛋白诱导组相似,但改变程度较小。空白对照组和大黄素对照组表达α-SMA、E-cadherin、FN的mRNA水平差异无统计学意义(均P>0.05)。与空白对照组比较,24和48h白蛋白诱导组、大黄素干预组α-SMA、FN的mRNA随时间延长表达逐渐增强,E-cadherinmRNA逐渐减弱。24和48h大黄素干预组上述指标的表达改变弱于白蛋白诱导组(均P<0.05)。结论大黄素可以抑制人白蛋白诱导的HK-2细胞转分化,延缓肾间质纤维化的进展。

经前舒颗粒对郁怒反应模型大鼠海马脑区基因表达谱的影响

目的在基因水平上探索经前舒颗粒对郁怒反应模型大鼠海马脑区基因表达谱影响的药物作用靶点和机制。方法采用社会隔离和居住入侵方法制备郁怒反应大鼠模型,分别取正常组、郁怒反应模型组和经前舒颗粒用药组大鼠海马脑区进行基因芯片检测和生物信息学分析。用RT-PCR方法对差异表达基因Htr3b和GABABR2进行验证。结果与正常组相比,郁药组/郁模组比较共检出127个差异表达基因,其中郁模组/正常组上调而郁药组/正常组基因下调基因有55个,郁模组/正常组下调而郁药组/正常组基因上调基因有72个,主要有各类激素受体、信号转导蛋白、代谢酶、转运蛋白、细胞因子受体等,涉及神经活化配体-受体交互作用、甘油磷脂代谢和促分裂原活化蛋白激酶等调控路径。差异表达基因Htr3b和GABABR2的RT-PCR验证结果与基因芯片数据表达的趋势一致。结论郁怒情志刺激可导致大鼠海马Htr3b、Fgfr2、Grm8、Gmeb2等较多基因的表达水平改变,经前舒颗粒通过上调或下调这些差异基因表达,进而参与神经活化配体-受体交互作用等调控路径,使郁怒反应模型大鼠行为学异常变化得到一定程度地改善,以上结果为探讨经前舒颗粒的药物作用靶点和机制提供方向和线索。

肾素系基因多态及表达与抗高血压药物降压效应的关系

目的探讨血管紧张素转换酶(ACE)和血管紧张素原(AGT)基因多态及ACE和血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)mRNA表达与抗高血压药物降压效应间的关系。方法随机、单盲设计,入选90名原发性高血压患者随机分为3组,分别给予氯沙坦(Losartam)、赖诺普利(Lisinoprtl)及尼索地平(Nisodrpine),并测定患者ACE基因插入(I)/缺失(D)、AGT基因M235T多态及ACE、AT1 基因mRNA表达。结果①AT1 mRNA表达基础值在AGT基因MT及TT基因型明显高于MM型,而MT与TT型间无差异;②三种抗高血压药物在显著降低血压同时,也明显降低AT1 mRNA表达;③氯沙坦及赖诺普利降低ACEmRNA表达,且与舒张期血压(DBP)差值呈正相关,而尼索地平反使ACEmRNA表达升高,与DBP差值负相关。结论依据AT1 mRNA表达基础水平增高且同时为AGTT等位基因者或ACEmRNA表达基础高水平者均可优选作用于肾素系(RAS)的ACEI或AT1拮抗剂;而ACEmRNA表达基础低水平者则选择钙通道拮抗剂。

人工饲料组成对BmNPV-Bm表达系统外源基因表达活性的影响

为进一步提高家蚕杆状病毒—家蚕 (BmNPV Bm)表达系统的表达活性 ,通过改变人工饲料中桑叶粉、大豆粉、玉米粉和水分的添加量 ,探讨了人工饲料的营养组成对BmNPV Bm表达系统外源植酸酶基因表达活性的影响。在大豆粉含量相同的条件下 ,植酸酶基因表达活性随桑叶粉含量的增加而降低 ,桑叶粉含量为 10 %时表达量最高 ;在桑叶粉含量相同的情况下 ,大豆粉含量为 35 %时表达量最高 ;饲料含水量以添加干物重的 1 9倍时表达量最高。外源基因的表达活性与蚕体重的生长表现出一致的趋势。

三疣梭子蟹含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及其表达分析

为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为102bp,3′-UTR长度为87bp,开放阅读框长度为507bp,编码168个氨基酸,其中含有一个典型的由蛋白石终止密码子(220TGA222)编码的硒半胱氨酸(40U)。预测了该基因编码的氨基酸序列及其中的保守结构域,包括GPx家族签名序列(64LAFPCNQF71)、活性位点序列(152WNFEKF157)以及与酶催化活性相关的氨基酸位点包括谷氨酰胺(74Q)、精氨酸(90R和168R)和色氨酸(142W)。相似性比对和系统发育分析结果表明,三疣梭子蟹硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)与甲壳动物中的SeGPxs相似性较高,其中与拟穴青蟹SeGPx相似性最高,并与其在系统发育树中聚为一支。经血卵涡鞭虫侵染后(0—192h),SeGPx基因在三疣梭子蟹的血细胞、肝胰腺和鳃组织中的转录水平均发生显著性升高。该结果表明,SeGPx在三疣梭子蟹应对血卵涡鞭虫的免疫反应中发挥重要作用,可通过调控甲壳宿主体内被病原扰乱的氧化还原状态进而起到宿主组织保护作用。

婚飞行为影响中华蜜蜂性成熟处女蜂王的基因表达

婚飞是性成熟处女蜂王与雄蜂交配过程中的一个重要前奏,在该过程中蜂王体内伴随着一系列重要的生理变化。为了探究中华蜜蜂Apis cerana cerana处女蜂王婚飞过程中基因表达变化,本研究利用数字基因表达谱(digital gene expression,DGE)技术分析了中华蜜蜂性成熟处女蜂王飞行与未飞行之间的基因表达差异。经DGE测序,分别从两个样品中获得5.98和6.01百万条Clean标签。通过分析检测到250个基因有差异表达,其中133个基因在飞行蜂王中上调表达,117个基因在飞行蜂王中下调表达。这些差异基因可以归类到348个功能性类别和142个生化途径。结果表明中华蜜蜂性成熟处女蜂王在婚飞过程中大量基因的表达发生了变化。这些结果为进一步研究中华蜜蜂蜂王婚飞过程中生理变化的分子机制提供了重要的基因表达信息。

中华蜜蜂气味受体基因AcOr10的克隆及表达分析

【目的】中华蜜蜂Apis cerana cerana气味受体Or10是感受信息素的重要受体蛋白之一。本研究目的是克隆出该受体基因的序列,并分析该基因在雄蜂不同生理状态下触角和大脑中的表达特征,为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】采集中华蜜蜂雄蜂触角,提取其总RNA,采用RT-PCR技术克隆中华蜜蜂Or10基因的序列。利用生物信息学软件分析该基因的氨基酸序列。通过荧光定量PCR技术(q PCR)分析其在巢门口未性成熟雄蜂、巢门口性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂、巢脾上性成熟雄蜂触角和大脑中的相对表达量。【结果】克隆到中华蜜蜂Or10基因(命名为Ac Or10)(Gen Bank登录号:MF693365)c DNA序列,长度为914 bp,编码区长738 bp,编码246个氨基酸,其蛋白质分子量为28.163 k D,理论等电点为5.50。系统发育树结果显示,中华蜜蜂Ac Or10与西方蜜蜂Apis mellifera Am Or10、小蜜蜂Apis florea Af Or4-like基因聚成一支。荧光定量PCR结果表明,巢门口性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂触角中Ac Or10表达量显著高于巢门口未性成熟雄蜂和巢脾上未性成熟雄蜂触角中的表达量(P<0.05),但前两者以及后两者之间均差异不显著(P>0.05);巢门口性成熟雄蜂大脑中Ac Or10表达量显著高于巢门口未性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂大脑中的表达量(P<0.05),但后三者之间差异不显著(P>0.05);巢门口未性成熟雄蜂、巢脾上未性成熟雄蜂和巢脾上性成熟雄蜂触角中Ac Or10的表达量都显著高于相同生理状态下大脑中Ac Or10的表达量(P<0.05),但巢门口性成熟雄蜂触角和大脑中Ac Or10的表达量差异不显著(P>0.05)。【结论】推测Ac Or10与中蜂雄蜂性成熟相关,出巢飞行对触角Ac Or10表达量影响较小,但引起其脑部变化,进而影响雄蜂的交尾行为。

食管癌基因表达谱及其与细胞分化的相关性研究

目的:研究原发性食管癌基因表达谱,筛选与肿瘤细胞分化相关的基因,旨在寻找或定位食管癌分化相关基因,加深对其癌变分子机制的了解.方法:应用基因芯片技术对15例ESCC癌组织和正常组织的mRNA进行检测,并用生物信息学对检测结果进行分析.结果:在886条目的基因中有110(12.42%)条至少2次出现差异表达,与肿瘤分化直接相关的基因有16条(1.81%),其中表达上调的9条(1.02%),表达下调的7条(0.79%).结论:高通量的基因芯片技术筛选出大量的ESCC相关基因,从中可分析出与肿瘤分化相关的基因.对这些相关基因功能的验证将有助于找到ESCC发生、发展的关键基因或通路,并可作为ESCC诊断的指标和治疗的靶点.

胃癌耐药细胞特异表达新基因的部分cDNA克隆

目的:研究胃癌多药耐药(multipledrgresistance,MDR)相关基因。方法:应用差异显示技术,对人胃癌SGC7901细胞系及其长春新硷耐药细胞(SGC7901VCR)之间的差异表达基因进行了差异显示。结果:得到3个长春新硷耐药细胞特有的差异条带的cDNA克隆,命名为VRF1,VRF2与VRF3。RNA打点杂交证实,VRF1可在人胃癌SGC7901细胞中的长春新硷耐药细胞中特异表达,而在人胃癌非耐药的SGC7901细胞中不表达,可能与SGC7901肿瘤细胞耐药性产生有一定的关系。VRF2与VRF3为无差异的假阳性条带,本实验未对其做进一步地研究。结论:经序列测定分析,VRF1未在GenBank数据库中发现其同源序列,证实为一种新的基因序列。VRF1为3′端的非编码区序列,并有一个加尾信号AATAA。该序列已被GenBank数据库收录,编号为AI00266。