沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原的诊断价值探讨

用肠炎、鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白分别免疫56日龄ICR小鼠，经间接ELISA和直接凝集试验测定证实．产生了血清分型H抗原的抗体，亦产生了针对鞭毛蛋白共同抗原组分的抗体。同时，用灭活全菌抗原免疫3日龄伊莎鸡，经单抗CB8＋de7竞争ELISA测定，灭活肠炎、鼠伤寒沙门氏菌免疫组同样测出较高滴度共同抗原表位的抗体。进一步用都柏林、鼠伤寒和肠炎沙门氏菌活菌分别人工感染56日龄ICR小鼠、3日龄伊莎鸡和140日龄SPF鸡．用单抗竞争ELISA亦检测出鞭毛蛋白共同抗原表位的抗体。这些结果表明：沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原表位可作为新的检测对象，在该菌感染诊断方面具有重要意义。研究中证实．单抗竞争ELISA为检测该类表位抗体提供了新方法。

沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的鉴定

应用针对沙门氏菌鞭毛蛋白且具有广谱反应性的单抗证实了该蛋白上存在共同抗原表位，进一步鉴定了鞭毛蛋白基因表达产物，结果同样表明该类共同抗原表位的存在。通过对该共同抗原表位在沙门氏菌属内外的分布规律测定，显示出它的属特异性。用单抗ＣＢ８和ｄｅ７构成检测该共同抗原表位的试剂，经对现场分离菌株的鉴定及样品中沙门氏菌检测试验，结果表明该抗原表位可作为该菌属鉴定的新识别标志，且在快速检验方面有着重要应用价值。

应用噬菌体肽库技术定位沙门氏菌鞭毛蛋白上属特异性共同抗原表位

用生物素标记的沙门氏菌属特异性单克隆抗体de7作为分子探针 ,应用亲和筛选法从噬菌体肽库中筛选该单抗所针对的表位克隆 ,最终进行定位。经三轮筛选后 ,用斑点印迹法检测 ,得到良好的富集效果。通过免疫筛选法从第三轮筛选物中挑取了 2 4个阳性克隆 ,再以斑点印迹、竞争ELISA进一步鉴定阳性克隆 ,证实已获得了沙门氏菌鞭毛属特异性共同抗原的模拟表位。测得的序列为SRRSFTTTE ,将其与沙门氏菌鞭毛蛋白氨基酸序列相比较 ,同源性较小 ,但在不同血清型沙门氏菌鞭毛蛋白氨基酸序列的Ⅰ区高度保守序列中 ,发现 6 1 6 5位氨基酸的RSXXT序列与所得的线性表位有相同的排列 ,而大肠杆菌鞭毛蛋白氨基酸在此段的序列为RAXXT ,且这种序列排列的几率为 1/2 0 5,因此推断该单抗所针对的表位在该区段上。此外 ,以阳性克隆免疫Balb/c小鼠 ,并制备高免血清进行间接荧光检测和竞争ELISA鉴定 ,结果表明其具有优良的免疫原性和高度的特异性 ,这亦为模拟表位疫苗的研究提供了新思路。

单克隆抗体测定沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位的分布特性

本研究应用抗沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原的４株羊克隆抗体所建立的直接ＥＬＩＳＡ法，测定了该类抗原表位在沙门氏菌属内外的分布特征。对１８４株覆盖Ａ至Ｏ６７血清群沙门氏菌、９６株其他肠道杆菌和８株革兰氏阳性菌的测定结果显示，该共同抗原表位广泛分布于沙门氏菌全属内，而在属外出现的频率很低。这类表位既存在于Ⅰ相较毛，也存在于Ⅱ相鞭毛。它们的上述分布特性不同于分型抗原Ｏ、Ｈ的分布特征。由此可见，沙门氏菌鞭毛蛋白共同抗原表位具有高度的属特异性，可作为该菌属识别标志，在沙门氏菌快速检验和抗原结构研究方面具有重要应用价值。

MAGE-A家族抗原共同B细胞表位预测分析

目的：预测和筛选黑色素瘤抗原A（MAGE-A）家族抗原的共同B细胞表位。方法：以MAGE-A1的全长氨基酸序列为基础,利用生物信息学软件,采用Hopp＆Woods的亲水性方案、Zimmerman极性参数和Jameson-Wolf抗原指数方案和Emini表面可及性方案等,结合MAGE-A1的二级结构与其柔性区域及跨膜区域对MAGE-A1的优势B表位区段进行综合分析,进一步运用抗原指数分析预测MAGE-A1的B细胞表位,并将其与MAGE-A家族中其他成员（MAGE-A2至A12）进行比对,以预测MAGE-A家族抗原的共同B细胞表位。结果：MAGE-A1的全长为309个氨基酸,相对分子质量为46 kDa,为可溶性蛋白。经综合分析,其B细胞优势表位可能存在于氨基酸序列N端的9~14,84~88,118~124,160~165,208~214,233~240区段;经与MAGE-A家族中其他成员的氨基酸序列比对,MAGE-A1的9~14,84~88,118~124及233~240区段,即HCKPEE,EEEGP,RAREPVTK,GEPRKLLT肽段可能为MAGE-A家族抗原共同B细胞优势表位。结论：利用生物信息学预测发现MAGE-A1的优势B细胞表位中,9~14,84~88,118~124及233~240区段可能为MAGE-A家族抗原的共同B细胞表位,可为表位疫苗的研制等提供理论依据。

沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原表位及其免疫生物学特性

本研究在研制出针对沙门菌鞭毛蛋白的属特异性单抗基础上,应用该单抗在免疫荧光、免疫胶体金试验、SDS-PAGE和免疫转印分析中,证实鞭毛蛋白携带该菌属共同抗原表位,并定位于F27片段上。通过分离,鉴定与表达鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白基因fliC^i,又在基因水平揭示出该类表位的遗传背景。对该类抗原表位分布规律和抗原性的分析,阐明了它的属特异性和属内的广谱性、良好的免疫原性和多种表位的特性,这与分型H抗原表位明显不同。大量试验证实,该类表位可作为沙门氏菌属识别标志,为该菌快速检验和鉴定提供了新途径,为分类学研究提供了新证据。

鳗鲡病原性气单胞菌外膜蛋白基因全长的克隆与抗原决定簇分析

为寻找存在于鳗鲡病原性气单胞菌间的共同外膜蛋白保护性抗原。通过NCBI/GenBank数据库检索,找出气单胞菌多种外膜蛋白的序列信息,经比对后找到一条高度保守的基因序列片段。据相应片段从嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和杀鲑气单胞胞菌(A.salmonicida)的全基因组序列中钓出Ⅱ型孔蛋白基因的全长序列及该基因区域之外两端的序列。根据嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞胞菌这两端序列的保守区域设计一对特异性引物,用该引物扩增到鳗鱼病原库30株气单胞菌中11株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全长,经测序后获得10株菌的Ⅱ型孔蛋白基因全长序列。选择遗传距离居中菌株,对该基因推导的表达产物进行蛋白结构预测、亲水性和抗原决定簇分析后发现,这些蛋白均具有三级结构,亲水性强且具有丰富的抗原决定簇。不同菌株的多个抗原决定簇经比对分析后,寻找到存在于多株鳗鲡病原性气单胞菌间的6个保守抗原决定簇。为养殖鳗鲡病原菌外膜蛋白共同保护性抗原的基因工程疫苗研究奠定了理论基础。

堆型艾美耳球虫子孢子和鸡十二指肠上皮细胞的共同抗原的研究

以抗堆型艾美耳球虫子孢子的单抗EASP-3G3作为工具,对鸡各段消化道上皮细胞切片和子孢子进行免疫组化染色,并利用蛋白质印迹技术来检测单抗所识别子孢子可溶性抗原的分子量,来确定子孢子和十二指肠上皮细胞之间是否存在共同抗原.结果表明单抗只与十二指肠上皮细胞发生反应,而与其他肠段无染色反应.而且单抗所识别的可溶性抗原分子量为35～48 ku.抗子孢子的单抗同时与十二指肠上皮细胞和子孢子反应,而不与其他肠段反应,证明堆型艾美耳球虫寄生的位点特异性与十二指肠上皮细胞表面的某种抗原分子有内在的关系.

抗支原体共同抗原单抗的筛选及应用

利用猪鼻 (mhy)、肺炎 (mp)支原体作为免疫原 ,采用杂交瘤技术建立 7株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞。所分泌的抗体用ELISA法检测与Mo、Ma、Mhy、Al及Mp 5种支原体的反应性 ,其中甲H5和丁D3细胞所分泌的抗体与 5种支原体均发生反应。表明这两种抗体是针对 5种支原体共同抗原的 ;以丁D3抗体作为一抗 ,采用间接荧光法分别检测 5种支原体感染的Vero细胞均为强阳性 ,其敏感性高于培养法 ,与DNA染色法相当 (2 0 0个 /ml) ;以甲H5抗体为包被抗体 ,丁D3抗体为酶标抗体 ,采用双抗体夹心法检测培养上清中支原体敏感性为 12 5ng/ml。用两种方法检测 2 0份支原体阳性细胞株 ,10份阴性细胞株标本 ,结果间接荧光法显示 2 0份阳性标本全部为阳性 ,10份阴性标本 1份为阳性 ;双抗体夹心法 2 0份阳性标本中 10份为阳性 。

广谱抗革兰氏阴性菌单克隆抗体3A8识别表位的初步研究

目的:利用噬菌体肽库技术筛选抗广谱革兰氏阴性菌与LPS单克隆抗体3A8的识别表位,以获得来源于不同LPS的保守表位。方法:用广谱抗G-菌、LPS的单克隆抗体3A8为靶,筛选噬菌体环七肽库,ELISA鉴定阳性噬菌体克隆并测序。根据阳性保守序列合成短肽A2及A5,并与KLH载体交联,ELISA鉴定A2-KLH、A5-KLH与3A8单抗的结合。结果:随机挑选的33个噬菌体克隆中有15个可特异性与3A8结合,该结合可被LPS2630所抑制。根据阳性克隆DNA序列推导氨基酸序列,共有7种序列,均以疏水氨基酸为主,且包含保守序列Ser Pro Pro/Pro X Pro;选择所获阳性序列经设计与改造合成延长的两个环肽;经ELISA鉴定表明这些环肽可特异地与3A8结合。结论:得到可被3A8单抗特异性识别并含保守残基Ser Pro Pro/ProX Pro的阳性序列,据此合成的短肽可特异性结合3A8,提示该短肽可能模拟LPS共同表位的抗原性,有望成为疫苗候选表位。

杆状病毒包涵体蛋白的共同抗原性

在比对已公布的37种杆状病毒包涵体蛋白氨基酸序列的基础上,选定棉铃虫核型多角体病毒(HaNPV)多角体蛋白的两个高度保守多肽(54-113aa和206-245aa)制备多克隆抗体,用Western blot法检测这两个高度保守多肽与多种杆状病毒包涵体蛋白之间的血清学关系.结果表明,HaNPV多角体蛋白的两个多肽的抗体与14种核型多角体病毒的多角体蛋白和5种颗粒体病毒的颗粒体蛋白均有明显的杂交信号,表明杆状病毒的包涵体蛋白之间具有共同的抗原决定簇.根据杆状病毒包涵体蛋白之间的这种血清学关系,进一步讨论了利用免疫金试纸技术检测病毒杀虫剂中包涵体含量的可行性.

淋病奈瑟菌共同抗原表位在淋病快速检测中的临床应用价值

目的研究淋病奈瑟菌共同抗原表位在淋病快速检测中的临床应用价值。方法根据各型淋病奈瑟菌外膜蛋白PIB上共同抗原表位的氨基酸序列合成一段多肽(WSWLF),并将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联构成完全抗原WSWLF-KLH,免疫动物,收集抗血清,ELISA和Western blot检测WSWLF-KLH免疫原性和特异性,并用于临床已确诊的169例淋病患者血清的检测及与传统金标准方法进行对比。结果实验室ELISA检测表明,WSWLF-KLH具有免疫原性,免疫动物能刺激机体产生较强的体液免疫反应,兔血清抗体和豚鼠血清抗体效价最高分别达到1∶3200和1∶25600;抗血清能与淋病奈瑟菌临床株特异性结合,与葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌和真菌等其它微生物之间没有交叉反应。Western blot结果显示,抗血清能识别淋病奈瑟菌裂解物,产生特异性条带,相对分子质量为37300。临床实验结果显示,抗血清的淋病检出率与传统的金标准方法结果相似率为93.49%。结论淋病奈瑟菌共同抗原表位具有免疫原性,免疫血清能与大多数淋病奈瑟菌结合,该抗原表位作为快速检测试剂有较高的临床应用价值。

基于虾类原肌球蛋白共同表位肽抗体的过敏原检测方法

目的建立一种能够同时检测多种虾原肌球蛋白的方法。方法通过合成不同虾类的共同表位肽,制备能够识别多种虾类原肌球蛋白的共同表位肽多克隆抗体,建立快速灵敏的虾类原肌球蛋白酶联免疫检测方法。结果该检测方法在4.79～1400 ng/mL的浓度范围内线性关系良好,其线性回归方程为Y=-19.083X+98.303(R^2=0.9813),最低检出限(IC_(10))为1.85 ng/mL;样品加标回收率在94.37%～103.45%之间;该检测方法与软体动物的原肌球蛋白有交叉反应,与鱼肉蛋白、牛奶、花生蛋白等无交叉反应;批内变异系数为3.4%～9.1%,板间变异系数为12.9%～19.6%,贮藏试验显示该酶联免疫试剂盒可以在4℃下保存6个月以上,能够应用于食品中虾类过敏原的检测。结论采用共同表位抗体,成功建立了基于酶联免疫的过敏原检测方法。

4株沙门氏菌鞭毛蛋白属共同抗原组分免疫原性及免疫保护性的研究

采用酸解法、单抗亲和层析提纯了鼠伤寒沙门氏菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）鞭毛蛋白Ｈｉ。经电镜和ＳＤＳＰＡＧＥ鉴定，发现４２ｋＤ的蛋白带，即鞭毛蛋白（Ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）。它能够刺激小鼠产生特异性抗体，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、凝集试验（ＤＡ）测定其Ｈｉ抗体效价分别为１：１０４、１：１０３。用其他非Ｈｉ抗原的沙门氏菌包板，ＥＬＩＳＡ效价可达１：１００～１：１０００，ＤＡ阴性。这表明沙门氏菌鞭毛蛋白上存在着属特异共同抗原表位，且免疫原性较好，该类表位免疫性比分型Ｈ抗原弱，提示沙门氏菌分型Ｈ抗原表位是鞭毛蛋白分子上的优势表位。用沙门氏菌鞭毛蛋白属特异共同抗原表位单抗ｄｅ７研究被动保护作用，结果显示该表位被动保护作用很小。本研究为沙门氏菌鞭毛蛋白抗原多样性及特性研究提供了新的认识，并为临床上诊断沙门氏菌感染提供了新的检测对象。