不同树龄茶树套种滇龙胆对药材矿质元素含量的影响

采用电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）与不同树龄（3年、4年、5年、9年、12年和15年）茶树（Camellia sinensis）套种后其根、茎、叶3个部位及生长土壤中7种矿质元素（B、Ca、Cu、Fe、Mn、Ni和Zn）的含量。结果显示,滇龙胆中矿质元素平均含量高低顺序为Ca（5 238±2 111）μg/g、Fe（622±238）μg/g、Mn（379±301）μg/g、Cu（75±9.1）μg/g、Zn（46±13）μg/g、B（17±4.9）μg/g、Ni（5.6±3.1）μg/g,与土壤矿质元素含量变化趋势基本一致。根部的B、Ca、Fe、Mn、Ni元素在树龄15年茶树-滇龙胆套种后含量最高,分别为18、3 797、1 050、254、11μg/g,Cu、Zn元素在树龄12年的茶树-滇龙胆套种中含量最高,分别为244、38μg/g。相同营养器官不同树龄的茶树-滇龙胆套种后矿质元素含量具有差异,以根部的Cu、Mn元素含量差异显著,变化范围分别为19~244μg/g和79~254μg/g,分别相差12.8倍和3.2倍;树龄15年、9年的茶树-滇龙胆套种后茎部的Cu含量分别为177、11μg/g,相差16.1倍;树龄3年、5年的茶树-滇龙胆套种后叶部的Cu含量分别为325、11μg/g,相差29.5倍。不同树龄的茶树-滇龙胆套种后根部与土壤矿质元素的相关性以及生物富集系数不同,树龄15年的茶树-滇龙胆套种后根部对Ca、Cu、Mn、Ni、Zn元素的富集能力较强,生物富集系数分别达21.0、3.3、2.2、1.8和4.7。说明茶树复合种植可改变土壤矿质元素的分布,自身生物学特性与复合种植的生态环境共同影响了滇龙胆对矿质元素吸收与运输的能力。

林药复合种植的滇龙胆中元素的化学计量特征研究

药用植物复合种植是对传统中药材种植模式的优化,在一定程度上可缓解中药材与作物争地的矛盾,对中药资源的保护与可持续发展具有重要意义。试验通过采集单一种植模式的滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.）样品以及滇龙胆与茶树[Camellia sinensis（L.）O.Ktze]、大叶桉（Eucalyptus robusta Smith）、木瓜[Chaenomeles sinensis（Thouin）Koehne]、旱冬瓜（Alnus nepalensis D.Don）、核桃（Juglans regia L.）、杉木[Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook.]、木果石栎[Lithocarpus xylocarpus（Kurz）Markg.]等林药复合种植模式的滇龙胆样品,用微波消解-ICP-AES法测定各滇龙胆样品中的Ca、Mg、Fe、Zn、P、Cu、Mn、Cd、Pb、Ni、Sr、Ti等元素含量,以探明不同种植模式下滇龙胆植株中元素的化学计量特征。结果表明,该方法的加标回收率在95.40%~108.25%,相对标准偏差在0.26%~2.08%。其中滇龙胆根中的元素含量排序为Ca、Fe、Mg、P、Mn、Zn、Ti、Sr、Ni,茎、叶中的为Ca、Mg、P、Fe、Mn、Zn、Sr、Ti、Ni。以滇龙胆-茶树复合种植模式的P元素含量最高,其在根、茎、叶中分别为1 384.73、1 640.12、2 399.04μg/g;滇龙胆-旱冬瓜复合种植模式的Fe和Ti元素含量最高;滇龙胆-大叶桉复合种植模式的Mg元素含量最高,其根、茎、叶中分别为1 486.08、2 770.99、4 673.24μg/g;滇龙胆-核桃复合种植模式的Sr元素含量最高,其根、茎、叶中分别为37.02、52.80、34.63μg/g。重金属元素Cd与Ca、Fe、Ni元素含量之间呈显著或极显著正相关,相关系数分别为0.741、0.929、0.893;Ni与Fe、Ti含量之间呈显著或极显著正相关,与Pb含量之间呈显著负相关;Mg与Cu含量之间呈显著正相关,Mn与Sr含量之间呈极显著正相关。

不同种植模式对滇龙胆草总裂环烯醚萜苷含量的影响

滇龙胆草（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.）为龙胆科（Gentianaceae）龙胆属（Gentiana Linn.）多年生草本植物，主要分布于云南、四川、贵州、湖南和广西等地，生长于山坡、草地、灌丛、林下及山谷中。该种为传统中药龙胆的基源植物，其干燥根及根茎均可入药，具有清热燥湿和泻肝胆火的功效。因其资源需求量逐年增加，滇龙胆草的人工种植越来越普遍，并出现了多种种植模式。目前滇龙胆草主要种植模式有单一种植和林药复合种植，常见的有滇龙胆草与茶树也Camellia sinensis （Linn.） Kuntze页、桉树（Eucalyptus robusta Smith）、木瓜也Chaenomeles sinensis （ Thouin ） Koehne 页和旱冬瓜（ Alnus nepalensis D. Don）的复合种植模式。与传统林业系统相比，林药复合系统具有良好的生态效益、社会效益和经济效益。周幸的研究结果表明：在太行山山地林药复合种植模式中，分布于土壤表层的药用植物浅根系对表层土有加筋固着作用，可减少水土流失。 Sujatha 等认为：在槟榔（Areca catechu Linn.）园间作芳香药用植物有助于提高其产量并增加单位面积收入。目前有关林药复合种植的研究主要集中于其生态效益和经济效益，对复合种植模式下药用植物有效成分变化的研究尚不多见。

不同激素组合对诱导滇龙胆顶芽及腋芽产生不定芽的研究

用滇龙胆的顶芽及侧芽为外植体,以MS培养基为基本培养基,以6-BA/NAA和KT/IAA两组不同浓度组合进行对比实验,研究诱导滇龙胆顶芽及侧芽萌发产生不定芽的最佳条件。发现在诱导率、产生的不定芽数、长势及不定芽出现时间等方面上,BA/NAA两种激素的互作用效果明显优于KT/IAA。其中以MS+BA3.0mg/l+NAA1.5—2.0mg/l的培养基上诱导率较高,可达100%,且小植株生长茁壮,叶色浓绿,大部分在10d左右可萌发出不定芽,产生不定芽数达7—9个。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术对滇龙胆组织培养的研究

野生药用植物资源的不断减少,使得寻找其原植物的合适替代品显得尤为重要。利用组培材料代替野生药用植物作为药源已取得重大进展,但利用傅里叶变换红外光谱(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)技术筛选合适的组培材料作为野生药用植物替代资源方面的应用鲜有报道。本研究采用FTIR结合偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)对滇龙胆组织培养形成的愈伤组织(肉质部、茎、叶)、增殖苗(肉质部、茎、叶)、生根苗(根、茎、叶)进行比较。结果显示:(1)从原始FTIR光谱图上看,滇龙胆肉质部和根部峰形相似,茎和叶峰形相似;(2)二阶导数光谱图扩大了样品间的差异。在龙胆苦苷的主要吸收峰1612 cm-1附近,吸收峰强度依次为:生根苗叶>增殖苗叶和生根苗茎>增殖苗茎>愈伤组织叶,愈伤组织茎及肉质部、增殖苗肉质部和生根苗根部在该处无吸收峰;(3)PLS-DA得分图表明,同一组培阶段相同组织部位样品聚集在一起,而愈伤组织、增殖苗、生根苗及其各组织部位能够较好的分开。其中:肉质部、根部与茎叶之间距离较远,表明其化学成分和含量可能差异较大;肉质部和根部样品间距离较近,茎和叶样品间距离也较近。二阶导数光谱图显示,组培材料有望代替其原植物满足药用需求;若以龙胆苦苷含量为评价对象,生根苗叶则可能具有更大的开发潜能,有望代替野生滇龙胆以缓解其资源稀缺局面。本研究结果表明,采用傅里叶变换红外光谱法可以简便有效地对药用植物不同组培阶段不同组织部位的替代潜力及开发利用进行初步评估。

濒危植物滇龙胆草的生态学、生物学特性研究

在滇西南地区对滇龙胆草(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)在自然状态下的生长环境、生长特性、繁殖特性、开花物候期以及资源状况等进行了考察。结果表明,滇龙胆草的野生种群在自然状态下仅为间断分布且种群内的植株数量较少,自种子萌发至植株开花结实需3年以上时间;开花后授粉方式以自花授粉为主,授粉后5～8 d子房开始膨大,果实成熟期为60 d左右,自然状态下结实率较高(82.4%),但种子萌发率(0.3%)较低;分蘖繁殖能力较低,每丛植株当年仅萌生1～2支茎。野生生境下滇龙胆草群体的更新主要是通过有性繁殖实现,自身繁殖缺陷及人为掠夺性采集是滇龙胆草野生资源濒危的主要原因。

滇龙胆优质种质筛选及离体培养条件优选研究

以大理州不同居群滇龙胆(Gentiana rigescens Franch.ex Hemsl.)、同一居群不同植株为试验材料,采用高效液相色谱法(HPLC)对滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷的含量进行测定;再以龙胆苦苷含量≥7.0%的优质种质资源为外植体,采用正交试验设计方法研究培养基、蔗糖浓度、pH及培养温度对滇龙胆离体培养植株再生的影响。结果表明,大理州6个居群滇龙胆根及根茎中的龙胆苦苷含量较高,不同居群间龙胆苦苷含量具有显著差异(P<0.05),以鹤庆县居群的龙胆苦苷含量最高(80.70 mg/g),含量最低的巍山县居群也超过国家药典规定标准的2倍多;同一居群内不同植株滇龙胆根及根茎中龙胆苦苷含量差异较小,只有云龙县居群不同植株间具有显著差异(P<0.05),其他居群不同植株间无显著差异(P>0.05);滇龙胆生长点离体培养及植株再生最适培养基和培养条件是1/2MS+30 g/L蔗糖+pH 5.2+20℃/25℃变温培养,再生植株诱导率最高可达88.9%,试验初步建立了滇龙胆离体培养及植株再生体系。

滇龙胆栽培技术研究进展

对滇龙胆近年的种子生理、育苗、组织培养、栽培模式、生态因子影响、生长年限与采收期研究和病虫害等方面的研究情况进行了综述,为滇龙胆的进一步栽培研究提供参考。

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。

滇龙胆丛芽高效诱导与植株再生体系的建立

目的以滇龙胆Gentiana rigescens带叶茎尖、带芽茎段、叶片、根为外植体,建立滇龙胆高效、稳定的丛芽诱导体系,筛选出适宜的植株再生途径。方法以MS为基本培养基,在单因素实验的基础上,通过L16(45)正交及完全组合实验研究不同外植体和不同植物激素种类及其质量浓度对愈伤组织诱导、丛芽发生及植株再生的影响。结果带芽茎段为间接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L中培养10 d、节上腋芽开始萌发后,基部可诱导出再分化能力极强的愈伤组织,得愈率为97.73%;15 d后愈伤组织开始分化出绿色丛芽,分化率100%;30 d后不定芽分化系数达18.65,增殖系数可达63.58。带叶茎尖为直接器官发生最佳材料,其在MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+KT 0.5mg/L中培养30 d后,增殖系数亦可达44.36。2种材料培养获得的试管苗茎细瘦弱,不利于生根培养,试管苗在MS+6-BA1.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+KT 0.05 mg/L+PP333 10 mg/L中培养60 d后可获得健壮度大为改善的复壮苗。复壮苗生根则在1/2MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 2.0 mg/L中进行,45 d后可获得生长健壮的再生植株,生根率100%。再生苗移栽成活率达95%以上。结论建立的滇龙胆无性快速繁殖体系,为保护滇龙胆野生资源、优质种苗繁育提供了有效途径,也为其遗传转化研究奠定了实验基础。