粗茎秦艽与西藏秦艽(龙胆科)种间的形态学、染色体与分子界定

粗茎秦艽GentianacrassicaulisDuthieexBurk和西藏秦艽G.tibeticaKingexHook.f.的主要区别是前者花冠小、檐部蓝色,后者花大、檐部紫褐色;但二者在西藏东南部地区的形态界限不清楚,具有较多的中间形态过渡类型。本文以该地区居群作为主要研究对象,并以云南和西藏其他地区的典型形态类群为对照,比较研究了两个物种间的形态学、染色体和分子标记界定。共研究了10个居群69个个体的trnS-G和ITS序列、6个居群26株植株的染色体倍性和54份标本的形态变异。结果表明,花冠大小与染色体倍性密切相关。云南等地分布的粗茎秦艽均为二倍体(2n=26),花冠较小;西藏西部的西藏秦艽均为四倍体(2n=52),花冠较大。而西藏东南部的形态过渡类型也为四倍体,花冠较大,且其中的部分植株花颜色变浅,类似西藏秦艽。但母系与双亲遗传背景的分子标记都表明西藏东南部居群与典型形态特征上的粗茎秦艽聚为一支,应属于粗茎秦艽;ITS序列上也未发现杂合位点。这些分子证据都不支持近期杂交渗入造成形态过渡性的假设。综合分析表明多倍化造成了粗茎秦艽种内形态特征的变异,其四倍体个体与四倍体西藏秦艽在形态特征上的趋同,最终导致了二者在西藏东南部地区形态界限的模糊。但是,分子证据可以很好地区分这种多倍化造成的形态趋同。我们的研究结果还表明,综合利用分子、染色体和广义形态证据来解决近缘种之间种范围的界定具有更大的优势。此外,还讨论了粗茎秦艽不同染色体倍性的分布以及该高山物种可能的起源与扩散途径。

HPLC-ESI-MS^n法分析西藏秦艽花和川西秦艽花中的7种成分

目的:采用HPLC和电喷雾质谱联用技术分析西藏秦艽花与川西秦艽花中的7种化学成分.方法:液相色谱条件色谱柱:Agilent Zorbax ODS(5μm,4.6 mm×250 mm);流动相:乙腈(A)-0.4%醋酸水溶液(B)进行梯度洗脱;体积流速为0.4 m L/min;检测波长254 nm;电喷雾质谱采用负离子模式采集.结果:采用HPLC-ESI-MS^n法分析西藏秦艽花和川西秦艽花中的7种成分,分别为獐牙菜苦苷、异牡荆黄素、落干酸、龙胆苦苷、异荭草苷、獐牙菜苷及6'-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷.结论:HPLC-ESI-MS^n联用分析法可以鉴定分析西藏秦艽花和川西秦艽花中的7种成分,为该属植物成分的质量控制提供了科学依据.

西藏秦艽花中总黄酮含量的提取及测定研究

采用双波长分光光度法对西藏秦艽花中总黄酮测定进行实验,将从西藏秦艽花中提取出的异荭草苷定为对照品,选择406 nm与435 nm分别为该方法的测定波长与参比波长,通过AlCl_3显色法,得到西藏秦艽花药材的总黄酮含量为2.20%。分别以西藏秦艽花总黄酮提取时所用的提取溶剂浓度、提取时间和液固比为对象进行考察研究,再由正交试验表对总黄酮的提取进行实验设计,结果得到的西藏秦艽花总黄酮提取时所用的最佳条件是乙醇溶液浓度70%,超声提取时间40 min,液固比1∶25 g/mL。

濒危药用植物西藏秦艽群落特征研究

为掌握色季拉山西藏秦艽植物资源的分布情况和群落结构特征,在色季拉山西藏秦艽集中分布地段进行了样地设置调查,记录其生境条件、物种组成及群落内植物的盖度、多度等信息,并对群落内的植物种组成、重要值特性、多样性指数、区系特征、生活型、种群频度以及各群落间相似性进行了分析。结果显示:色季拉山西藏秦艽主要分布在海拔3 100~4 100 m的范围内,生境以林地边缘为主,坡向多且分散,坡度较缓,坡位多为下坡位。调查群落内维管束植物共有132种,隶属39科95属,双子叶植物在物种组成上占据较大比例。在群落植物的重要值结果分析上,草本植物为调查群落内的优势植物,构成群落植物的主体。群落植物的物种多样性指数均以草本层为最高。群落植物在科、属和种的区系分布上共有10个分布类型和7个变型,绝大多数植物科、属和种分布类型集中在北温带分布和世界分布类型上。植物生活型以地面芽植物分布最多,共有42种,占总种数的31.81%,高位芽植物和一年生植物相对匮乏。群落间相似性分析结果,10个调查群落被划分为4个类群。结论:色季拉山西藏秦艽群落植物的组成以草本植物为主,在区系分布上有强烈温带性质,这与西藏秦艽生长和分布特性相一致。此次西藏秦艽的生境资源条件及群落结构特征的分析研究,可为其野生资源的保护和利用提供科学依据。

HPLC法测定西藏秦艽花与川西秦艽花中7种成分的量

目的建立测定西藏秦艽花和川西秦艽花中落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、异荭草苷、异牡荆黄素7种成分的HPLC方法。方法采用Agilent Zorbax ODS（250 mm×4.6 mm,5μm）色谱柱,流动相为乙腈-0.4%醋酸水溶液梯度洗脱,体积流量0.4 m L/min,检测波长254 nm,柱温30℃。结果落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、异荭草苷和异牡荆黄素分别在0.228~2.280、0.680~6.800、0.220~2.200、1.476~14.760、0.200~2.000、0.436~4.360、0.276~2.760μg进样量与峰面积积分值线性关系良好（R^2≥0.999 2）,落干酸、6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、龙胆苦苷、獐芽菜苷、异荭草苷及异牡荆黄素的平均回收率（n=9）分别为100.9%、99.4%、101.0%、105.7%、103.1%、98.4%、104.2%。结论该法简便、准确、专属性强,可用于西藏秦艽花和川西秦艽花中7种成分的测定。

西藏秦艽花的化学成分研究

目的研究西藏秦艽Gentiana tibetica花的化学成分。方法采用正相硅胶、SephadexLH-20、反相C18柱色谱及制备高效液相等色谱技术进行分离纯化，根据IR、ESI-MS、^1H-NMR、^13C-NMR分析鉴定化合物结构。结果从西藏秦艽花的95％乙醇提取物中分离得到12个化合物，分别鉴定为macrophyllosideD（1）、orientin7-caffeate（2）、7-O-femloylorientin（3）、异牡荆黄素（4）、皂草黄苷（5）、异荭草苷（6）、6＇-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷（7）、獐牙菜苷（8）、獐牙菜苦苷（9）、落干酸（10）、二十-烷醇（11）、蔗糖（12）。结论化合物1～12均为首次从该植物中分离得到。

基于叶绿体全基因组序列的双峰法鉴定粗茎秦艽及其近缘物种

粗茎秦艽Gentiana crassicaulis Duthie ex Burk.为中药“秦艽”的基原植物之一,而同为龙胆属秦艽组的西藏秦艽Gentiana tibetica King ex Hook.f.、粗壮秦艽Gentiana robusta King ex Hook.f.为其近缘的非国家药典品种。因存在较大的种内形态变异,粗茎秦艽与西藏秦艽、粗壮秦艽间表现出较高的形态相似性,且存在一定的同域分布,为粗茎秦艽的鉴定带来了一定的难度。为有效鉴定中药秦艽国家药典品种粗茎秦艽与其近缘的非药典品种,本文基于前期测定的粗茎秦艽、粗壮秦艽叶绿体基因组序列,首次测定西藏秦艽叶绿体基因组序列,筛选分子标记并构建这三个物种的分子鉴定方法。结果如下:①获得西藏秦艽叶绿体基因组序列,长度为148765 bp,大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSC)分别为81163 bp和17070 bp,反向重复区(IR)为25266 bp;②粗茎秦艽、西藏秦艽、粗壮秦艽的叶绿体基因组结构一致;粗茎秦艽与西藏秦艽的重复序列、SSR分布情况一致,两个物种间叶绿体基因组变异位点数仅为9;③筛选同时对这三个物种有效鉴定的单核苷酸多态性位点(SNP),并验证稳定性;④建立SNP双峰检测方法,对各物种及混合样品进行有效鉴定。本工作可为粗茎秦艽及其近缘物种的DNA分子鉴定,以及相关藏药品种的整理等工作提供基础资料。