白地霉Y162脂肪酶基因克隆及其在毕赤酵母中的高效表达

借助生物信息学,对已克隆的地霉属脂肪酶全长基因序列进行同源比对,根据保守序列设计引物,在基因组DNA和cDNA水平上,于国内首次克隆了Geotrichum candidum Y162脂肪酶基因。G.candidum Y162脂肪酶基因全长1692bp,不含内含子,编码包括19个氨基酸信号肽在内的563个氨基酸。与NCBI GenBank中已报道的地霉属脂肪酶氨基酸序列有86%的一致性。将该基因克隆到pPIC9K表达载体上,转化毕赤酵母GS115,摇瓶发酵96h后毕赤酵母分泌表达55 U/mL重组脂肪酶,实现了脂肪酶的高效表达。酶学性质研究表明,该重组脂肪酶对C9位顺式双键的甘油酯具有明显的底物特异性;对甲醇、甘油等有机溶剂呈现耐受性;最适温度和最适pH分别为50℃和8.0,在pH 6.0～10.0及60℃以下能保持60%以上的酶活力。底物特异性、有机溶剂、温度及pH耐受性赋予该重组酶良好工业应用潜力。

单因子-响应面法优化白地霉Y162产脂肪酶条件

对白地霉Y162液体发酵产脂肪酶的条件进行了优化。首先采用单因子实验筛选出最适碳源为橄榄油,氮源为黄豆粉和NH4Cl,无机盐为BaCl2和MgCl2。在此基础上,利用Plackett-Burman设计对影响产酶因素的效应进行评价,筛选出具有显著效应的橄榄油、BaCl2和NH4Cl三个最显著的因素。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后,利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化,得出橄榄油、BaCl2和NH4Cl最佳浓度分别为2.35%,0.36%,1.35%。优化后液体发酵液中脂肪酶活力提高到31.85U/ml,比初始酶活力14.16U/ml提高了2.25倍,表明单因子-响应面结合法可显著优化白地霉Y162液体发酵产脂肪酶条件。