棉花GhCOMT1基因原核表达载体构建及蛋白纯化和Western鉴定

为进一步研究GhCOMT1基因的功能,构建了原核表达载体pET-28a-GhCOMT1,酶切鉴定并测序后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,在0.2mmol/L IPTG浓度条件下分别进行不同温度梯度诱导,用蛋白标记亲和层析柱(His TrapTM HP)对重组蛋白进行纯化,并用SDS-PAGE和Western blotting方法鉴定表达产物。结果表明:16℃诱导12h、30℃诱导3h和37℃诱导3h后融合蛋白均以包涵体的形式表达,其中16℃诱导12h的蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测目的蛋白相对分子量约为39.748kD;Western blotting分析表明,目的蛋白能与His多克隆抗体起特异性反应。

棉花pGUS-GhCOMT1基因融合载体构建及转化验证

为了深入研究GhCOMT1基因的功能,确定GhCOMT1基因对棉纤维细胞壁增厚的影响。本实验通过构建棉花木质素合成途径中的咖啡酸-O-甲基转移酶基因GhCOMT1的瞬时表达载体,用将pRTL2-GUS/NIa瞬时表达空载体连接GhCOMT1基因的目的片段,获得pGUS-GhCOMT1融合表达载体,并将其转化到棉花胚珠表皮细胞中进行表达。通过检测可以发现pGUS-GhCOMT1融合表达载体在洋葱表皮细胞及棉花胚珠表皮细胞中高效表达,表明棉花GhCOMT1基因对棉纤维的的伸长有显著的影响,同时为研究棉花纤维发育调控的分子机理提供理论基础。