应用Gibson Assembly法快速构建人组蛋白甲基化转移酶启动子荧光素酶报告载体

目的:快速构建人组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)启动子荧光素酶报告载体并验证其活性。方法:因EZH2启动子富含GC,故应用Gibson Assembly方法设计分两段扩增,然后将片段一步法连入pGL3-Basic质粒,构建荧光素酶报告载体,进行酶切鉴定。与p RL-TK内参照质粒共转染C4-2细胞,双荧光素酶分析法检测启动子的活性。结果:经酶切鉴定证实成功构建了EZH2启动子报告载体,双荧光索酶报告基因检测结果显示构建的报告载体具有启动子活性。结论:快速成功构建了具有启动子活性的EZH2启动子荧光素酶报告载体,为进一步研究前列腺癌中EZH2表达调控机制提供必要的实验材料。

应用Gibson Assembly方法构建植物表达载体

【目的】构建方便快捷的植物表达载体。【方法】应用Isothermal in vitro recombination system or “Gibson Assem-bly”方法设计包含片段间20～25 bp互补重叠序列的引物，通过PCR扩增出带有首尾重叠的目的DNA片段，可将1个或多个片段和线性化的载体一步组装成表达载体。【结果和结论】利用该方法快速构建了多个水稻基因的全长以及部分缺失编码区表达载体。此外，还通过对Gibson Assembly连接产物进行PCR扩增后再连接到载体，提高多DNA片段组装的效率。本方法不受目的片段内部限制性酶切位点的限制，可广泛应用于各种载体的构建。

Gibson Assembly系统构建双标签原核类泛素蛋白表达载体

目的体外构建表达原核类泛索蛋白（prokaryotic ubiquitin-like protein，Pup）的载体是研究Pup化靶蛋白的重要基础，为了提高蛋白纯化的效能和特异性需要构建带组氨酸（his6）和链霉素（strep）标签的Pup蛋白表达载体，为后续研究Pup-蛋白酶体在分枝杆菌中的应激调控奠定基础。方法设计合成his6-strep片段，扩增富集his6．strep片段，从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增Pup片段；应用Gibson Assembly系统采用同源片段重组方法将his6-strep片段和PUP片段依次连接到载体上，构建带双标签的原核表达载体pET28a—his6-strep-Pup和大肠肝菌-结核杆菌穿梭质粒pMV261-his6-strep—Pup表达载体，经酶切和聚合酶链反应验证，分别导人大肠杆菌（E．coli）和耻垢分枝杆菌（M．sm）中，鉴定和测序获得正确单克隆菌株。培养富集菌株，超声破碎离心收集上清和沉淀，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）电泳，用免疫印迹法（Western blot）验证标签蛋白在E．coli和M．sm中的表达。结果经聚合酶链反应鉴定及测序，证实成功构建了双标签Pup表达载体并导人目的菌株，诱导后蛋白表达，Western blot结果表明标签蛋白在E．coli和M．sm中均可得到正确表达，在M．sm中可发现多种靶蛋白被Pup化结合。结论快速高效地构建了表达his6-strep．Pup蛋白的双标签重组载体，可以应用于后续Pup的表达纯化及Pup化蛋白的功能分析，为进一步开展对Pup-蛋白酶体在分枝杆菌应激调控中的功能研究打下了良好的基础。