青少年正畸治疗早期牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K的变化研究

目的分析牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K在青少年正畸治疗早期的变化。方法随机收集青少年正畸牙龈正常者45例,分别取矫治器戴入前,戴入后1、2、3、6个月龈沟液标本,应用16S r DNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌及其毒力因子牙龈蛋白K;采用SPSS17.0软件包对数据进行统计分析,牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K各组间检出率比较用χ2检验;牙龈卟啉单胞菌、牙龈蛋白K的检出率与牙龈炎症之间的关系用Spearman等级相关分析。结果牙龈卟啉单胞菌在矫治前与戴入后1个月有显著性差异(P<0.05),与2个月、3个月之间有极显著性差异(P<0.01);戴入后1个月与2个月之间有显著性差异(P<0.05);牙龈蛋白K在矫治器戴入前与戴入后1个月、6个月之间无显著性差异,与戴入后2个月、3个月之间有显著性差异(P<0.05);从第2个月开始牙龈卟啉单胞菌与牙龈蛋白K的检出率下降,到6个月时检出率已基本接近矫治器戴入前。结论青少年正畸治疗过程中在矫治器戴入早期可引发牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K的增加,出现牙龈炎症反应,当增加到一定时间即2个月后开始逐渐下降,到6个月时已基本接近矫治器戴入前。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K催化结构域的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 :克隆牙龈卟啉菌蛋白酶K催化结构域 (kgpcd)基因 ,并使其在大肠杆菌中获得表达。方法 :利用PCR方法克隆kgpcd ,并用基因重组融合表达技术获得在大肠杆菌中的表达。结果 :克隆基因测序结果与GeneBank数据库中的序列一致 ,经诱导表达见Mr为 5 6× 1 0 3 的融合蛋白。结论 :成功克隆了kgpcd的基因 ,并在大肠杆菌中表达了KGPcd蛋白 。

牙龈卟啉单胞菌及其牙龈蛋白酶K对青少年牙龈健康的影响

目的分析牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis）及牙龈蛋白酶K（Kgp）对青少年牙龈健康的影响。方法收集12-17岁青少年牙龈正常组（50例）、牙龈炎症指数Ⅰ级组（25例）和牙龈炎症指数Ⅱ级组（32例）的3组龈沟液标本,应用16SrDNA PCR技术检测各样本中的P.gingivalis及Kgp。3组P.gingivalis和Kgp阳性检出率的比较采用χ2检验;P.gingivalis和Kgp的相对含量与牙龈炎症指数之间的关系采用Spearman相关分析。结果 P.gingivalis在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组、Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）,牙龈炎症指数Ⅰ级组与Ⅱ级组间差异具有统计学意义（P〈0.05）。Kgp在牙龈炎症指数Ⅰ级组的检出率大于牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅱ级组的检出率大于牙龈炎症指数Ⅰ级组和牙龈正常组,牙龈炎症指数Ⅰ级组与牙龈正常组间差异具有统计学意义（P〈0.05）,牙龈炎症指数Ⅱ级组与牙龈正常组间有明显差异（P〈0.01）。P.gingivalis和Kgp的检出率随着牙龈炎症指数的增加而升高。结论 P.gingivalis和Kgp与青少年牙龈健康密切相关。

正畸治疗中牙龈蛋白K与牙龈炎性反应的关系

目的:分析牙龈蛋白K(gingipain K,Kgp)在正畸治疗中对牙龈炎性反应的影响。方法:选择青少年牙龈健康者45例,分别取矫治器戴入前与矫治器戴入后3个月的龈沟液,应用16S r DNA PCR技术检测各样本中的牙龈卟啉单胞菌(P.g)及Kgp,采用SPSS17.0软件包对数据进行统计学分析。结果:矫治器戴入前Kgp检出率为35.71%,矫治器戴入后Kgp检出率为67.86%,两者之间差异显著(P<0.05)。结论:正畸治疗患者在矫治器戴入后Kgp检出率增加,出现牙龈炎性反应。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因真核表达载体的构建和体外表达

目的 :构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体 ,并检测其在体外真核细胞中的表达情况。方法 :利用基因重组技术构建牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K基因重组质粒pcDNA3.1( + ) -KGPcd ,然后通过脂质体将 pcDNA3.1( + ) -KGPcd瞬时转染COS7细胞 ,以RT -PCR和间接免疫荧光法检测重组质粒的转录水平和蛋白表达情况。结果 :成功构建了牙龈蛋白酶K真核表达载体 ;转染的COS7细胞中可检测到目的蛋白的转录和表达。结论 :成功构建了 pcDNA3.1( + ) -KGPcd真核表达载体并在哺乳动物细胞中能够正确转录和表达 ,为下一步作为基因疫苗免疫动物提供了依据。

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K活性与青春期龈炎的临床相关性

目的:检测并比较青春期龈炎患者的龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的活性,探讨Kgp在青春期龈炎中的临床意义。方法:受试对象为36例14～17岁青春期龈炎患者,检测并记录受检者的各牙周临床指标GI、SBI、PD的测值,取龈下菌斑进行P.gingivalis的分离培养,16S rRNA聚合酶链反应(PCR)法鉴定。将P.gingivalis临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用N-p-硝基苯胺乙酸盐分析Kgp的氨基酸溶解活性。采用SPSS11.0软件包,分泌蛋白与菌体蛋白的Kgp活性比较用t检验;Kgp活性与各牙周临床指标之间的相关关系用秩相关检验分析,P<0.05具有显著性差异。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白中Kgp的活性高于菌体蛋白(P<0.01),Kgp的活性与GI、SBI、PD之间有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.05)。结论:Kgp酶活性的高低与青春期龈炎的严重程度有关。

牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域融合蛋白的纯化及其多克隆抗体的制备

目的纯化牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K催化结构域(KGPcd)融合蛋白并制备其多克隆抗体,为下一步的实验提供条件。方法 KGPcd蛋白与载体pET-16b中的His标签融合表达,用Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,复性后用Western blot检测。以重组、纯化的KGPcd蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,用间接ELASA法检测抗体效价,Western Blot进行抗血清特异性试验。结果经亲和层析、复性得到纯化融合蛋白His-KGPcd,Western blot进一步证实纯化的蛋白为His-KGPcd融合蛋白。抗血清稀释达1:3200时,ELASA法仍有明显的抗原抗体反应,Western blot也进一步证实抗血清能够与KGPcd发生特异性反应,抗体仅特异识别目的蛋白。结论成功制备兔抗KGPcd多克隆抗体,为后续研究奠定基础。

青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K的表达

目的:检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶K(Kgp)的表达强度,揭示Kgp与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法:受试对象为14～17岁青春期龈炎患者36例,检测并记录受检者的各牙周指数GI、SBI和PD测值,取龈下菌斑进行P.gin-givalis的分离培养,16SrRNAPCR法鉴定。将P.gingivalis临床分离株于对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,用抗KgpN-末端IgG亚基的单克隆抗体进行Westernblot检测,采用SPSS11.0软件包,秩相关检验分析Kgp的表达强度与各牙周指数之间的相关关系。结果:青春期龈炎的P.gingivalis临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中,KgpN-末端IgG亚基的表达强度与各牙周指数数值的高低有正相关关系,统计学上有显著性差异(P<0.01)。结论:Kgp对青春期龈炎有一定的致病作用。

牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K的基因克隆和序列分析

利用PCR方法 ,分别扩增牙龈卟啉菌牙龈蛋白酶K (KGP)的催化结构域 (KGPcd)和凝集素结构域 (KGP hag)的基因片段 ,将基因片段插入pGEM TeasyVector,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定 ,KGPcd和KGP hag的序列与国外文献报道一致。克隆到牙龈卟啉菌KGP的KGPcd和KGP hag基因 ,为体外表达其活性蛋白奠定了基础。

牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响

目的·观察牙龈素提取物对小鼠脑神经炎症的影响。方法·采用超声破膜结合低温超速离心,并通过超滤浓缩的方法从牙龈卟啉单胞菌ATCC33277获得牙龈素提取物。对牙龈素提取物进行蛋白定量后行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,经湿转法转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,封闭后分别使用赖氨酸特异性牙龈素(lysine-gingipain,Kgp)抗体和精氨酸特异性牙龈素(arginine-gingipain,Rgp)抗体对样本进行孵育,以检测提取物中的牙龈素免疫原性。通过向C57BL/6N小鼠腹腔注射牙龈素提取物建立小鼠牙龈素急性感染模型。在小鼠腹腔注射牙龈素提取物后的不同时间点,分别采用针对Kgp和Rgp的特异性荧光底物Z-His-Glu-Lys-MCA和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA检测小鼠血浆中2种牙龈素的活性。将40只C57BL/6N小鼠随机分为4组,分别为对照组、牙龈素组、牙龈素+Kgp抑制剂(COR388)组和COR388组。预先给予COR388处理1 h后,再腹腔注射牙龈素提取物,24 h后麻醉下取材,脑组织经固定、脱水、包埋、切片等步骤后,分别使用离子钙适配分子1(ionized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)抗体和神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体标记小鼠大脑皮层小胶质细胞和星形胶质细胞,采用免疫组织化学技术观察上述4组小鼠大脑皮层小胶质细胞及星形胶质细胞的激活情况。采用酶联免疫吸附测定检测大脑皮层肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达水平。结果·蛋白质印迹分析显示,该牙龈素提取物在截留分子量50000和70000附近有较清晰的条带,表明该提取物具有牙龈素免疫原性。此牙龈素提取物具有生物活性,腹腔注射牙龈素提取物后,小鼠血浆牙龈素活性呈现先升后降的趋势。腹腔注射牙龈素提取物后4~8 h,小鼠血浆牙龈素活性达到峰值,随后逐渐下降。免疫组织化学结果显示,小鼠大脑皮层的小胶质细胞和星形胶质细胞体积增大,且具有不规则突起,提示腹腔注射牙龈素提取物可激活小鼠脑内小胶质细胞和星形胶质细胞。酶联免疫吸附测定结果表明小鼠大脑皮层炎症因子TNF-α和IL-1β表达水平升高。结论·急性感染牙龈素提取物可促进小鼠脑神经炎症。

牙龈卟啉单胞菌基因真核表达载体构建及其在哺乳动物细胞中的表达

目的 构建分泌型牙龈卟啉单胞菌牙龈蛋白酶K基因的真核表达载体VR10 2 0 KGPcd ,并检测其在哺乳动物细胞中的表达及分泌情况。方法 应用基因重组方法 ,构建真核表达载体VR10 2 0 KGPcd。然后用Lipofectamine2 0 0 0介导瞬时转染COS7细胞 ,以反转录聚合酶链反应 (RT_PCR)和间接免疫荧光检测重组质粒的基因转录和蛋白表达 ,酶联免疫吸附实验 (ELISA)检测培养上清中蛋白分泌情况。结果 转染的COS7细胞中可检测到目的基因的转录和表达 ,并且在培养的上清中检测到其表达的蛋白质。结论 成功构建了可分泌表达的真核表达载体VR10 2 0 KGPcd ,并在哺乳动物细胞中能够正确转录和翻译 ,培养上清中可检测到正确表达的目的蛋白 ,这为其作为基因疫苗免疫动物奠定了基础。

牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K-caspase样亚基的表达与青春期龈炎的临床相关性

目的检测并比较青春期龈炎的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中牙龈蛋白酶 K(gingipain K,Kgp)-caspase 样亚基的表达强度及酶活性,揭示 Kgp 与青春期龈炎之间可能存在的致病关系。方法检测并记录36例14～17岁的青春期龈炎患者的牙龈指数、龈沟出血指数及探诊深度,取龈下菌斑进行 Pg 的分离培养,16S rRNA PCR 法鉴定。将获得的10个 Pg 临床分离株复苏,在对数生长期末提取分泌蛋白和菌体蛋白,测定其酶活性,并用Kgp-caspase 样亚基的单克隆抗体进行 Western blot 检测。Kgp 的表达强度及酶活性与各牙周指数之间的相关关系用等级相关系数。结果青春期龈炎的 Pg 临床分离株的分泌蛋白和菌体蛋白中,Kgp-caspase 样亚基的表达强度及酶活性与各牙周指数的大小呈正相关关系,差异有统计学意义(P<0.05)。结论青春期龈炎龈下菌斑中 Pg 的 Kgp 十分复杂,存在表现为低相对分子质量形式的caspase 样活性分子,这些细胞内功能蛋白分子将影响 Pg 和宿主间的相互作用;Kgp 对青春期龈炎有一定的致病作用。