叶籽银杏的发生及其个体与系统发育研究述评

叶籽银杏是银杏资源中一个极为奇特的种质,具有重要的观赏和学术价值。目前,中国和日本已报道的叶籽银杏共有47株,树龄36～1200年不等,叶生种子发生率为5%～25%。银杏的可育短枝整体上相当于松柏类的一个雌球果(大孢子叶球)。叶籽银杏可能与种子蕨和苏铁类等有较近的亲缘关系。叶籽银杏的发生机制有返祖学说、衰老学说、环境诱变学说等,综合分析后提出嵌合体学说,其发生可能与同源异型盒基因的表达有关。本文对目前叶籽银杏的分类地位的多种观点进行评述,系统概述叶籽银杏的分布状况,形态解剖学、细胞生物学、分子生物学研究现状,分析银杏雌性生殖器官的形态学本质,及叶籽银杏可能的亲缘关系,对叶籽银杏可能的发生机制进行了探讨,并提出叶籽银杏研究中存在的几个主要问题及今后研究的建议。

10种叶籽银杏染色体核型分析

本研究以叶籽银杏幼叶为试材,对来自河南、广西、云南、湖北以及山东等省的10个种质进行核型分析及倍性鉴定,并对核型与进化的关系进行了分析和探讨。结果表明:该10个种质的染色体数目均为2n=2×=24,核型主要由中部着丝粒染色体(m)和近中部着丝粒染色体(sm)组成,共有2A、3A、2B和3B四类核型;染色体相对长度组成中以中短(M1)、中长(M2)染色体为主,稀有长(L)染色体;邓肯检验表明:山东叶籽实生子代(未表达)和湖北种质的染色体长度比(3.97、1.87)及广西种质和山东叶籽实生子代(未表达)的核型不对称系数、平均臂比值(68.65%和2.36,62.14%和1.72)差异显著;四川种质较原始,广西种质的进化程度最高。

不同单株叶籽银杏DNA甲基化水平与模式的MSAP分析

以叶籽银杏和普通银杏叶片为试材,利用EcoRⅠ和HpaⅡ/MspⅠ双酶切建立适合于叶籽银杏全基因组的甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析体系,在全基因组水平对11株叶籽银杏和1株正常银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,从36对MSAP选扩引物中,选出14对MSAP引物组合,共扩增产生2766条清晰可辨且可重复的DNA条带,产生3种类型的甲基化条带。在全部扩增位点中,检测到叶籽银杏基因组CCGG序列的甲基化比率为26.42%～65.79%,正常银杏总甲基化率达30.79%,不同单株的叶籽银杏平均总甲基化率达38.61%,叶籽银杏甲基化事件的发生频率为11.27%～27.34%。方差分析显示不同单株间DNA甲基化水平差异极显著。主成分分析绘制的主分量散点图与聚类分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。

银杏叶生小孢子囊比较形态学及系统意义

运用常规石蜡切片方法，结合光学显微镜和扫描电镜技术对作者发现的中国第一株叶生小孢子囊银杏的比较形态学及系统意义进行研究。叶生小孢子囊雄株有正常小孢子囊和叶生小孢子囊两种类型。叶生小孢子囊常着生在某些短枝的叶片边缘，这些叶片明显较正常叶片小，叶片顶端或两侧常有1-3个深裂刻（lobe），在裂刻处堆积1-9个不等的小孢子叶，或者小孢子叶1-3 （5）个聚生在叶柄叶片交界的叶柄两侧，小孢子叶无柄。着生小孢子囊的叶片除在小孢子囊着生处叶片加厚外，解剖结构和正常叶片无明显差异，均由表皮，叶肉，叶脉3部分组成，栅栏组织和海绵组织分化不明显。叶生小孢子囊的数量、着生位置和形态具多样性。正常小孢子囊近椭圆形，叶生小孢子囊近圆形，孢子囊壁4 -7层细胞，散粉期绒毡层已经退化，仅留痕迹，孢子囊内分布大量花粉。叶生小孢子叶的花粉极轴和赤道轴分别为19.99和13.60μm，每个叶生小孢子（花药）有花粉1.86万粒。正常花粉为光滑型，而叶生小孢子囊花粉为粗糙型。叶生小孢子囊花粉具有萌发能力。叶生小孢子囊银杏的个体发生，表明银杏的小孢子叶有叶性来源的性质，叶生小孢子囊银杏可能是一种奇特的嵌合体。对叶生小孢子囊银杏的系统发生进行了探讨。

不同单株叶籽银杏DNA甲基化MSAP分析

利用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术对11株叶籽银杏的胞嘧啶甲基化水平和模式进行评估。结果表明,叶籽银杏基因组的CCGG序列中检测到36.86%～46.43%的DNA发生甲基化。本研究从36对选扩增引物中筛选出14对引物组合,共得到2879条清晰可辨的带,叶籽银杏总体平均DNA基甲基化水平为42.14%,甲基化模式以内侧胞嘧啶为主,其中,外侧胞嘧啶甲基化水平为11.90%～23.90%,内侧胞嘧啶甲基化水平为17.03%～28.37%。UPGMA聚类分析和主成分分析结果一致,不同单株的叶籽银杏可分为3大类。推断叶籽银杏的变异机制可能与DNA甲基化有关。

叶籽银杏GbMADS5基因的克隆与序列分析

MADS-box基因是一类编码转录因子的基因大家族,在植物的发育过程中具有重要作用。本研究采用RT-PCR技术从叶籽银杏(Ginkgo biloba var.epiphylla Mak.)中克隆了MADS-box基因GbMADS5。序列分析表明,该基因编码区全长为666bp,含有一个完整的开放阅读框,编码221个氨基酸残基组成的蛋白质,具有典型的植物MADS-box基因结构,编码肽链包含了MADS区、I区、K区和C末端,但该基因不具有拟南芥(Arabidopsis thaliana)AG基因的N端区域。GbMADS5基因编码的蛋白序列与其它植物的MADS-box蛋白序列有着较高的一致性,与裸子植物(Gymnospermae)的AG基因相似性最高,其中与苏铁(Cycas revolute)的同源性高达91.07%。系统发育树分析显示,GbMADS5基因属于AG亚家族基因。

叶籽银杏叶的解剖结构及气孔特性

以来自沂源县、在中国首次发现的叶籽银杏为试材，对其叶的解剖结构及气孔特性进行研究。结果表明：正常叶片叶肉有栅栏组织和海绵组织的分化，而叶生拟胚珠叶片叶肉由同型薄壁细胞组成；叶片着生拟胚珠部位有脊状突起；突起处的叶肉由大型薄壁细胞构成，叶脉位置分叶脉在突起的两侧和叶脉在突起的正上方2种类型，而且其叶脉均较正常部位的叶脉密集。首次发现，叶生拟胚珠叶叶柄在紧贴韧皮部外侧的基本组织中存在3～4层木质化的细胞。叶籽银杏叶片气孔在上下表皮均有分布，其气孔器单环式；有些叶生拟胚珠叶片下表皮气孔沿叶脉排列成不规则的气孔行。对叶籽银杏与其他裸子植物和蕨类的亲缘关系进行探讨。

叶籽银杏种实形态解剖特征比较

以山东境内发现的8株叶籽银杏正常种实和叶生种实为试材,对其种实形态多样性进行比较研究。结果表明:1)成熟的叶生种实具有明显的外种皮、中种皮、内种皮、胚乳、珠领。叶生种实形态上具有多样性,在叶顶端或边缘着生1～2(15)个大小不等的胚珠,珠领不连续。核体顶端锐尖,或直立,或为喙状,内种皮中缢线明显移向珠孔端、上端赤褐色的内种皮缺如或萎缩。种仁仅有胚乳、无胚。2)叶生种实质量和种核质量约为正常种实质量和种核质量的1/3,叶生种仁质量约为正常种仁质量的1/4。正常种实和叶生种实出核率分别为25.23%和20.16%,出仁率分别为74.26%,48.91%。对银杏的胚珠及种实的植物学和栽培学术语进行了说明。

叶籽银杏成熟种子脱落特性及种子形态指标分析

以山东沂源一株叶籽银杏为试材,对其成熟种子的脱落特性和形态指标进行研究,结果表明:9月15日至10月10日,共收集落种1 109个,日均落种数为48个。种子脱落明显分为脱落前期、中期和后期,脱落中期为9月27日至10月4日。9月16日的种重是6.24 g,9月22日出核率是35.57%,10月5日出仁率是64.17%。本研究对探讨叶生种子发育生理过程有重要意义。

叶籽银杏叶形态特性研究

本研究以来自沂源县中国首次发现的叶籽银杏为试材,对其叶的形态特性进行了研究。结果表明,发育期内叶生拟胚珠叶的叶长、叶宽、叶鲜重和叶面积均较正常叶小,但两者的叶柄长几乎没有差异。遗传距离聚类分析结果表明,正常叶各形态指标分为3类,叶生拟胚珠叶分为2类。正常叶叶宽与叶鲜重的相关性最大,叶生拟胚珠叶叶长与叶鲜重的相关性最大。本文对叶籽银杏的形态学本质进行了讨论。

中国首次发现叶籽银杏子代无性系叶生胚珠表达——兼论其遗传稳定性

叶籽银杏是银杏这一孑遗物种的特殊种质,长期以来国内外学者对其实生和营养繁殖的后代叶生胚珠(叶生种实)的表达十分关注。该研究首次发现,从800年生的叶籽银杏母树上采集接穗嫁接12年后有6株幼树出现叶生胚珠并发育成正常叶生种实,这也是世界上仅有的6株幼龄叶籽银杏。叶籽银杏表达株率占9.68%,平均叶生种实率为0.074%。嫁接再生的叶籽银杏形态特征、种实特性、生长特性、变异特性与母树相同,表明叶籽银杏可视为一个品种,并具有稳定的遗传特性。

叶籽银杏叶生种子的形态特征

观察山东沂源5株叶籽银杏的成熟种子形态，发现叶生种子形状多样，大小较正常种子小1／2～1／4，背凸腹平；核体内上部1／5～3／5处为“空腔”，棱线不明显；内种皮珠孔端棕色，萎缩、皱褶或不发育；种仁多种形状，较圆滑。测定叶生种予的种质量、核质量分别为3．72、0．79g，出核率、出仁率分别为21．40％、48．50％。

叶籽银杏种质遗传多样性的AFLP评价

文章对来自日本和中国的8株叶籽银杏亲缘关系进行了评价，从64对EcoRI／MseI引物中筛选出7对清晰、多态性高的引物，对8个叶籽银杏种质的亲缘关系进行了AFLP分析。7对引物共产生841条谱带、240个特异位点和749条多态带，多态带的比例平均为89．06％，每对引物鉴别效率达到100％，所有种质之间相似系数（SC）在0．48～0．78之间，表明叶籽银杏单株问存有较大的遗传变异，中国的叶籽银杏具有较丰富的遗传变异。

日本垂枝、叶籽、喇叭、斑叶及雌雄同株银杏资源调查

简述日本垂枝银杏、叶籽银杏、喇叭银杏(我国文献称"筒叶银杏")、斑叶银杏及雌雄同株银杏实生大树、古树资源概况。查有可靠依据者共有117株,其中垂枝银杏14株、叶籽银杏78株(包括3株雄株)、喇叭银杏19株、斑叶银杏4株、雌雄同株银杏2株。部分单株兼具垂枝、叶籽、喇叭、斑叶性状中的2个或3个性状,因此共有107株。实际上,该类资源的数量要远多于此。多数单株为各级政府指定的"天然纪念物",其中国家级指定"天然纪念物"叶籽银杏8株,雌雄同株银杏1株。

叶籽银杏发端期分泌腔发育过程中的细胞程序性死亡

以普通银杏为对照,通过树脂半薄切片和扫描电镜观察,研究叶籽银杏胚珠分泌腔的发育过程。结果表明:叶籽银杏胚珠具有发达的分泌结构,2种银杏分泌腔在发育中均表现出细胞程序性死亡的特征。其表现为:随着胞间隙的形成,细胞壁先解体,之后中央分泌细胞解体,随后其相邻的细胞降解,分泌泡被临近的细胞吞噬,无炎症反应,表明是自体吞噬的作用,最终形成分泌腔。二者的分泌腔均属于裂溶生型分泌腔。

叶籽银杏种质资源染色体核型分析及进化趋势

以来自日本、中国山东等地的28株叶籽银杏种质幼叶为试材,采用常规压片法,对其核型进行了研究。结果表明:各种质染色体均为二倍体,2n=2x=24,核型有中部着丝粒染色体(m)、近中部着丝粒染色体(sm)和近端部着丝粒染色体(st)等3种类型;有6个种质具随体。方差分析表明:种质SY2染色体长度比与其它种质差异显著,为3.97;各种质的平均臂比和核型不对称系数之间差异较大。种质GX3和种质HB较进化,种质NS2较原始。

叶籽银杏胚乳淀粉特性及其系统学意义

旋光法和凯氏定氮法测定表明,叶籽银杏正常种子和叶生种子胚乳淀粉含量分别为63.22%和61.91%;蛋白质含量分别为11.35%和13.36%。SEM观察结果表明,叶籽银杏淀粉粒形状大多为球形和椭圆形,有A、B、C(大、中、小)3种类型。正常种子和叶生种子均含有A和B型淀粉粒,C型淀粉粒仅在叶生种子中发现。正常种子A型淀粉粒大小为14.28μm×11.96μm,长轴/短轴比为1.24;叶生种子分别为13.63μm×10.55μm和1.30。正常种子B型淀粉粒大小为8.29μm×7.28μm;叶生种子为8.90μm×7.68μm。叶生种子C型淀粉粒大小为2.07μm×1.84μm。与正常种子相比,叶生种子淀粉粒特点是大小不一,B型和C型淀粉粒明显可见以"出芽"方式从大淀粉粒上长出,淀粉粒间空隙大,基质蛋白丰富,淀粉粒上有凹陷区。淀粉粒类型、大小、形态和含量在不同单株间存在较大差异,不同单株的基质蛋白质存在较大差异,尤其在正常种子和叶生种子间淀粉粒和蛋白质相互连接方式及在淀粉粒上的分布差异明显。叶生种子淀粉含量低及形态多样性与其胚乳发育滞后、种粒小有关。对叶籽银杏淀粉粒的系统学意义进行了探讨。

叶籽银杏正常种子与叶生种子中种皮及内种皮超微结构观察

以来自山东沂源、泰安、济南的6株叶籽银杏的正常种子和叶生种子为试材,通过扫描电镜对两种类型种子的中种皮和内种皮进行了超微结构比较研究。研究发现,正常种子的中种皮均是由管胞构成,管胞壁上具有明显的穿孔,为具缘纹孔。而叶生种子的管胞类型则存在差异,织女洞、仲庄、济南、泰安取材的叶籽银杏的叶生种子管胞有具缘纹孔管胞和螺纹管胞两种类型。从油坊、白峪取材的叶籽银杏的叶生种子的管胞类型和正常种子一样,是由具缘纹孔管胞构成。就管胞长度和管胞直径而言,叶生种子比正常种子有更大的变异。6株叶籽银杏的内种皮超微形态也存在较大的差异。基于研究结果,对叶籽银杏的管胞演化和系统学意义进行了讨论。

叶籽银杏叶生胚珠的发育组织化学研究

采用树脂半薄切片技术对叶籽银杏叶生胚珠生长发育各阶段进行观察及组织化学分析。结果表明:(1)叶生胚珠发端期在叶片上表现为"突起"状态,其结构主要为维管束、薄壁细胞和分泌腔;其内中央淀粉粒少,与叶缘结合处淀粉粒多,淀粉粒小且沿细胞壁分布。(2)叶生胚珠雌配子体的发育经历了游离核阶段和细胞化阶段;游离核阶段雌配子体呈液体状态;细胞化初期,雌配子体内是大的薄壁细胞,无淀粉粒、脂肪和蛋白质的分布;随后淀粉粒渐多;细胞化后期淀粉粒进一步增多,变大,且有黑色脂滴在细胞壁附近。(3)胚乳发育阶段,细胞中积累淀粉粒,蛋白质增多,营养物质中心密集,边缘稀疏。(4)雌配子体游离核阶段开始有外珠被和中珠被的分化;7月上旬叶生胚珠出现明显的内珠被。(5)中珠被与内珠被间中隐线上方有一"锥状"结构,外珠被和中珠被间有较多的淀粉粒。

叶籽银杏授粉期胚珠的形态结构变化

通过树脂半薄切片和扫描电镜技术对叶籽银杏(Ginkgo biloba L.var.epiphylla)叶生胚珠和正常胚珠授粉期的发育过程进行了观察比较。结果发现:授粉前,正常胚珠各组织已分化完全,珠被迅速生长,在珠心顶端逐渐靠拢;而叶生胚珠此时没有珠托和珠心分化,仅有脊状的突起,主要靠突起内的维管束供给营养,随着突起不断发育,有栅栏组织和海绵组织的分化。授粉期,正常胚珠有珠心组织分泌的授粉滴和珠心发生程序性死亡形成的贮粉室;而叶生胚珠未发现授粉滴的存在,已有珠心和珠被的分化,珠孔呈喙状,珠孔道伸长,但在珠孔道的下方没有发生细胞的退化,因此不能形成贮粉室。授粉后,叶生胚珠和正常胚珠进入雌配子体游离核阶段。与正常胚珠相比,叶生胚珠外观形态体积明显偏小,呈不对称发育。对叶籽银杏败育的机理进行了讨论。