Gli2调控Hedgehog通路活化对Tca8113细胞增殖、转移和上皮间充质转化的影响

目的 本研究通过在细胞水平检测Gli2对口腔癌细胞Tca8113增殖、生长、迁移和侵袭的影响,明确Gli2调控口腔癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法 本研究利用siRNA抑制Tca8113细胞中Gli2的表达,通过CCK-8、平板克隆以及transwell小室实验分别检测Gli2对Tca8113细胞增殖、生长、迁移与侵袭的影响。进一步利用qRT-PCR与Western blot实验探究Gli2调控Tca8113细胞恶性增殖和转移机制。结果 口腔癌细胞Tca8113中Gli2的mRNA和蛋白表达升高。干扰Gli2表达可抑制Tca8113细胞增殖、生长、迁移及侵袭。进一步研究发现干扰Gli2表达可抑制Hedgehog(Hh)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。此外,干扰Gli2表达可显著影响上皮间充质转化(epithelial mesenchymal transformation, EMT)通路关键因子的mRNA与蛋白表达。结论 口腔癌病变过程中Gli2被异常激活,干扰Gli2表达显著抑制口腔癌细胞的增殖、生长、迁移和侵袭。Gli2通过调控Hh通路与EMT通路,进而影响口腔癌细胞的迁移和侵袭。本研究为阐明口腔癌的发病机制提供新思路,并为口腔癌的临床治疗提供新视角。

Smo、Gli2及FoxM1对神经胶质瘤诊断和预后的评估价值

目的 探讨Smo、胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Gli2)及叉头框转录因子M1(FoxM1)对神经胶质瘤诊断和预后的评估价值。方法 取80例神经胶质瘤标本为神经胶质瘤组,60例正常脑组织标本为正常组。免疫组化法检测两组Smo、Gli2、FoxM1表达水平,分析其与神经胶质瘤患者临床病理特征的关系;Kaplan-Meier生存曲线分析不同Smo、Gli2、FoxM1表达水平神经胶质瘤患者预后的差异,分析影响神经胶质瘤预后的相关因素。结果 神经胶质瘤组织Smo、Gli2、FoxM1高表达率均高于正常脑组织,且随神经胶质瘤患者组织学分级升高而表达率增高(P<0.05)。不同组织学分级、不同Smo、Gli2、FoxM1表达水平的神经胶质瘤患者5年生存率存在显著差异(P<0.05)。组织学Ⅲ~Ⅳ级、Smo高表达、Gli2高表达、FoxM1高表达是神经胶质瘤预后的危险因素(P<0.05)。结论Smo、Gli2、FoxM1高表达是神经胶质瘤预后的危险因素,三者有望作为神经胶质瘤诊断和预后的判断指标。

Gli2在原发性肝细胞癌中的表达及与Cyclin D1、p21的关系

目的探讨原发性肝细胞癌(HCC)中Gli2、Cyclin D1和p21的表达及其意义。方法采用组织芯片和免疫组织化学方法以及RT-PCR检测了44对HCC和相应癌旁肝组织中Gli2蛋白和mRNA的表达情况,应用Western blot检测了Cyclin D1、p21蛋白在两种组织中的表达差异。结果免疫组化染色与RT-PCR示Gli2在HCC组织中的阳性表达率为68.2%,而癌旁肝组织为38.6%,两者差异具有极显著性意义(P<0.01),且Gli2与HCC的组织分化和门静脉转移相关。Cyclin D1蛋白在HCC中的表达显著高于癌旁肝组织(P<0.05),且与Gli2的表达呈正相关;而p21蛋白在癌旁肝组织中的表达显著高于HCC,但与Gli2无明显相关性。结论Gli2过度激活可能通过上调Cyclin D1的表达而使肝癌细胞异常增殖,参与HCC的发生和发展。

乙烯硫脲致畸胎鼠直肠末端Gli2基因的表达

目的 探讨乙烯硫脲致畸胎鼠直肠末端sonichedgehog(Shh)基因转录因子Gli2基因表达水平。方法 妊娠Wistar大鼠 2 4只随机分成 2组 ,实验组 (n =12 )在孕 11、13d分别给予 1%乙烯硫脲 (12 5mg/kg)胃管注入 ,对照组 (n =12 )予等量蒸馏水。孕 16d处死母鼠 ,实验组每只母鼠取 4只体质量相似的无肛畸形胎鼠 ,对照组取 4只体质量相似正常胎鼠 ,各取其直肠末端 1cm提取RNA ,采用RT PCR法检测Gli2基因表达 ,比较两组之间Gli2基因表达水平。结果 先天性无肛胎鼠直肠末端Gli2基因表达水平明显低于正常胎鼠直肠末端 (P =0 .0 0 4)。结论 Gli2基因表达水平减低与先天性无肛畸形的发生密切相关 ,乙烯硫脲致畸机制之一是影响Shh信号转导系统。

Gli2基因在胎鼠后肠发育后期的表达

目的探讨胎鼠后肠发育与sonichedgehog(Shh)基因转录因子Gli2基因表达水平的关系。方法48只妊娠Wistar大鼠随机分成2组,实验组(n=24)在孕11d按125mg/kg胃管注入1%乙烯硫脲(ethylenethiourea,ETU),对照组(n=24)给予等量蒸馏水。两组分别于孕12d、14d和16d各处死8只母鼠,每只母鼠取4只体重相似的胎鼠,取其直肠1cm提取RNA,采用半定量RT_PCR法检测Gli2基因表达。结果实验组胎鼠直肠Gli2基因表达水平明显低于对照组(P<0.05),实验组Gli2基因表达呈一低水平线,而对照组随妊娠时间呈一下降的曲线。结论Gli2基因表达水平在胎鼠后肠发育中具有重要的作用。

早期高分化浆液性囊腺卵巢癌中Ptch及Gli2表达情况

目的研究hedgehog(Hh)信号通路中Ptch及Gli2蛋白在卵巢癌中的表达及其临床意义。方法 60例早期高分化浆液性囊腺卵巢癌组织标本为实验组,30例正常卵巢组织标本为对照组,应用免疫组化法检测Ptch及Gli2在实验组及对照组中的表达。结果 Ptch及Gli2在实验组的表达均高于对照组(P <0. 05)。结论 Hh信号通路在卵巢癌组织中异常激活,且该信号通路可能参与卵巢癌的发生、发展过程,进而提示Hh是卵巢癌侵袭转移的一个重要信号通路,为进一步深化卵巢癌的机制研究和靶向治疗提供了一个新的思路。

肿瘤坏死因子-α联合转化生长因子-β1作用于原代白血病细胞对Gli2表达的影响

目的：证明肿瘤坏死因子-α（TNF-α）可以促进转化生长因子-β（TGF-β）降低原代白血病细胞Gli2的表达。方法 ：（1）Western blot检测白血病细胞Gli2蛋白的表达。（2）不同浓度TGF-β1和TNF-α分别作用于原代白血病细胞后,检测Gli2基因或蛋白以及TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ蛋白的表达。（3）TGF-β1、TNF-α及SIS3作用于原代白血病细胞24 h后,检测Gli2蛋白的表达。结果：（1）3株原代白血病细胞均有Gli2蛋白的表达。（2）1~10 ng/m L TGF-β1作用于原代白血病细胞12~24 h,与对照组相比Gli2基因m RNA表达降低明显;5 ng/m L TNF-α则没有显著变化。（3）5 ng/m L TNF-α作用于原代白血病细胞24 h后,与对照组相比TGF-βRⅠ和TGF-βRⅡ蛋白表达均有增高。（4）单独应用TGF-β以及联合应用TNF-α和TGF-β作用24 h后,与对照组相比Gli2基因的表达均降低明显,而且TNF-α＋TGF-β组Gli2基因的表达较TGF-β组降低更明显。结论：联合应用TNF-α和TGF-β比单独应用TGF-β能进一步减少原代白血病细胞Gli2基因的表达。

癌基因Gli2促进肾癌细胞的体外侵袭能力

目的:研究Gli2与肾癌细胞侵袭之间的关系。方法:采用免疫组织化学染色的方法对41例肾癌临床标本中Gli2的表达情况进行检测,并分析Gli2在局部侵袭性肾癌和非局部侵袭性肾癌中的表达差异。运用肾癌细胞模型,通过过表达Gli2质粒或添加Gli2特异性抑制剂干预细胞,采用体外侵袭实验分析Gli2在肾癌细胞侵袭能力中的作用,RT-PCR检测Gli2对细胞侵袭相关基因的调控作用。结果:Gli2蛋白在T_(3-4)期肾癌中的表达水平明显高于T_(1-2)期(P<0.05),Gli2过表达能明显促进肾癌细胞的体外侵袭能力,反之,Gli2特异性的抑制剂Gant61则显著减弱肾癌细胞的体外侵袭能力。Gli2抑制肾癌细胞上皮标记物E-Cadherin的表达,上调间质标记物N-Cadherin,Vimentin,MMP-2及MMP-9的表达;Gli2抑制剂的作用则相反。结论:Gli2通过调控侵袭相关基因的表达促进肾癌细胞的侵袭。

沉默Gli2基因对人肝癌细胞系SMMC-7721体外血管生成的影响

目的探讨胶质瘤相关癌基因2(Gli2)对肝癌细胞SMMC-7721体外血管生成作用及机制。方法设干扰组、对照组和空白组;构建靶向Gli2的shRNA重组慢病毒和阴性对照慢病毒,转染到SMMC-7721细胞,RT-q PCR和Western blot检测沉默效率;用体外血管生成实验检测血管生成能力;用ELISA检测SMMC-7721细胞上清液中VEGF-A、MMP-2分泌水平;用RT-q PCR、Western blot检测细胞内VEGF-A、MMP-2的表达差异。结果 shRNA慢病毒转染率为90%左右,干扰组与对照组和空白组相比Gli2表达降低(P<0.05);血管生成能力减弱(P<0.05);上清液中VEGF-A含量下降(P<0.05);细胞中VEGF-A、MMP-2表达明显降低(P<0.05)。结论沉默Gli2的表达能够抑制肝癌细胞SMMC-7721血管生成,其机制可能与VEGF-A、MMP-2的下调有关。

内源性转化生长因子-β对白血病细胞株Gli2基因表达的影响

目的探讨转化生长因子(TGF)-β信号通路对白血病KG-1细胞株Gli基因的调控作用。方法(1)ELISA法检测KG-1细胞培养上清液TGF-β1水平;(2)5μmol/L SIS3作用于KG-1细胞,时间分别为6、12、24 h。处理结束后收集细胞,提取mRNA,检测Gli2的表达。结果 (1)KG-1细胞的培养上清TGF-β1水平明显低于正常人组;(2)5μmol/L SIS3加入KG-1细胞分别作用6、12、24 h,与对照组(仅加入2甲基亚砜为SIS3的溶剂)相比较,其Gli2的mRNA表达明显升高;并且随着作用时间的延长,差异更加显著。结论 KG-1细胞有低水平的TGF-β1产生,TGF-β抑制KG-1细胞Gli2的表达是通过TGF-β/Smad3途径介导的。

Y-box结合蛋白1通过Gli2调控肝祖细胞增殖

目的探索Y-box结合蛋白1(YB-1)对肝祖细胞(HPC)增殖的影响及机制。方法慢病毒载体系统下调YB-1的表达,细胞增殖实验和流式细胞术检测细胞增殖和细胞周期;RNA测序分析YB-1对HPC表达谱的影响;染色质免疫共沉淀结合高通量测序(ChIP-sequence)检测YB-1在HPC中的靶基因;实时PCR和蛋白质印迹检测相关基因表达;ChIP-PCR验证YB-1与Gli2启动子结合;荧光素酶报告基因实验分析YB-1调控Gli2的转录;Gli1/Gli2阻滞剂与HPC共培养并检测细胞增殖。结果YB-1 mRNA下调67%和75%后HPC增殖率分别下降58%和70%;RNA-sequence显示YB-1能调控Hedgehog信号通路、Wnt信号通路以及MAPK信号通路;ChIP-sequence显示YB-1在HPC中的靶基因参与细胞粘附、Wnt信号通路、Hedgehog信号通路,且YB-1能结合于Gli2启动子区;ChIP-PCR和荧光素酶报告基因实验表明YB-1能与Gli2结合并正调控其转录;实时PCR和蛋白质印迹证实YB-1可以调控Hedgehog信号通路上多种信号分子的表达;与对照组相比,Gli1/Gli2阻滞剂处理后处于有丝分裂期的HPC细胞数下降60%以上。结论YB-1能与Gli2启动子区结合并正向调控其转录,进而调控HPC增殖。

端粒酶逆转录酶和Gli1、Gli2在胃癌中的表达及意义

目的探讨端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,h TERT)和Gli1、Gli2在胃癌组织中的表达及意义。方法利用免疫组化S-P两步法检测72例胃癌及其癌旁组织中h TERT、Gli1、Gli2的表达情况,并结合患者的临床病理资料进行分析。结果 h TERT、Gli1、Gli2在胃癌中的表达明显高于癌旁组织中的表达(P<0.05),h TERT与Gli1、h TERT与Gli2的表达均呈正相关(r分别为0.502 2、0.624 6,P<0.05)。h TERT、Gli1、Gli2的表达均与淋巴结转移有关(P<0.05)。h TERT、Gli1均高表达组以及h TERT、Gli2均高表达组生存时间较短,三者均高表达组生存时间最短(P<0.05)。结论 h TERT与Gli1、Gli2在胃癌中均高表达,三者联合检测对预测胃癌转移、预后有一定指导意义。

Gli2在髓母细胞瘤中的表达及其靶向抑制剂的作用与意义

目的探讨SHH(sonic hedgehog signaling pathway)信号通路下游转录因子Gli2在髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)中的表达及其靶向抑制剂对MB细胞增殖抑制的作用。方法使用不同浓度的Gli2特异性抑制剂GANT61作用Doay细胞,观察细胞形态的变化,采用CCK-8法检测细胞的增殖抑制作用,RT-PCR法和Western blot法分别检测Doay细胞中Gli2mRNA的表达量及Gli2蛋白表达水平的差异。结果使用GANT61作用细胞后,可见细胞形态出现明显改变,细胞异常突起增多;CCK-8法检测显示,与对照组相比,GANT61能够抑制Doay细胞的增殖(P<0.05),且细胞增殖的抑制率呈明显的剂量-效应关系;RT-PCR法显示Gli2特异性抑制剂GANT61组较对照组Gli2 mRNA的表达明显下降(P<0.05);Western blot法检测结果示GANT61抑制剂组较对照组Gli2蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论 GANT61主要通过抑制Gli2 mRNA的表达,下调Gli2蛋白表达水平而抑制MB的增殖生长。因此,Gli2可能是治疗MB的重要生物学标志物和生物治疗的潜在靶点。

Gli2基因在涎腺多形性腺瘤中的表达及其意义

目的:探讨Gli2基因在涎腺多形性腺瘤和正常涎腺组织中的表达水平及其在多形性腺瘤发生发展中的作用。方法:收集20例腮腺多形性腺瘤组织和20例相对应的瘤旁正常腮腺组织,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)方法检测Gli2基因mRNA的表达水平,分析其表达变化,并探讨Gli2基因在涎腺多形性腺瘤发生发展中的作用及其临床应用价值。结果:与正常腮腺组织相比,多形性腺瘤组织中Gli2基因mRNA的表达水平升高。结论:多形性腺瘤中Gli2 mRNA的高表达可诱导肿瘤细胞持续增殖,提示Gli2基因可能在涎腺多形性腺瘤的发生发展中具有重要作用。

Gli2对高糖条件下肾小管上皮细胞凋亡及ROS水平影响

目的:探讨胶质瘤相关癌基因2(Gli2)对高糖条件下的肾小管上皮细胞凋亡及活性氧(ROS)水平影响。方法:用肾小管上皮细胞NRK-52E为研究对象,分别转染Gli2过表达载体和对照载体,同时用不转染的细胞作为对照,RT-PCR和Western blot检测Gli2水平,用高糖和低糖细胞培养液培养不转染的对照细胞,同时以高糖培养液培养转染Gli2过表达载体的细胞,流式细胞术检测细胞凋亡,二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针法检测ROS含量,黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶(SOD)含量,Western blot检测Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、Ptch相关跨膜蛋白Smoothened(Smo)水平。结果:NRK-52E细胞转染Gli2过表达载体后的Gli2 mRNA和蛋白水平均明显高于对照细胞(P<0.01),而转染对照载体后的NRK-52E细胞中Gli2 mRNA和蛋白水平与对照细胞相比没有差异(P>0.05)。高糖培养后的不做转染的NRK-52E细胞凋亡率升高,ROS含量升高,SOD含量下降,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3水平升高,Smo水平下降,与对照细胞相比差异具有统计学意义(P<0.01)。而过表达Gli2后的NRK-52E细胞经高糖培养后,细胞凋亡率下降,ROS含量降低,SOD含量升高,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3水平下降,Smo水平升高,与单纯高糖培养的NRK-52E细胞相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论:高糖诱导肾小管上皮细胞凋亡和氧化损伤,Gli2可以降低高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡,减轻氧化损伤。

丹参含药血清抑制瘦素及Hh信号通路激活诱导的大鼠肝星状细胞中EVC2和Gli2表达上调

目的观察丹参含药血清是否可以通过抑制瘦素诱导的刺猬(Hedgehog,Hh)信号通路中纤毛蛋白(Ellis-van creveld syndrome protein 2,EVC2)和锌指转录因子2(GLI family zinc fingerprotein 2,Gli2)的表达从而抑制大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)的增殖。方法丹参水煎剂、生理盐水灌胃大鼠10天后收集各组血清。应用高效液相色谱仪检测丹参含药血清中有效成分(丹参素、丹参酮IIA)的含量。将处于对数生长期的HSCs传代于6孔板,分为6组(空白对照组、瘦素组、瘦素+抑制剂组、瘦素+丹参组、瘦素+激动剂组、瘦素+激动剂+丹参组),每组分别培养在相应含药血清中,24h后收集细胞。采用MTT检测细胞增殖情况,免疫荧光检测EVC2在各组HSCs中的表达,Western blot测定EVC2和Gli2蛋白水平,RT-PCR法检测EVC2和Gli2 mRNA水平。结果瘦素能刺激HSCs的活化增殖,使EVC2和Gli2表达量显著升高;Hh通路抑制剂和丹参能抑制瘦素对HSCs增殖的活化作用和对EVC2、Gli2表达的上调作用;丹参对Hh通路激动剂与瘦素共同作用所致的HSCs增殖极强活化和EVC2、Gli2表达极强上调也具有明显抑制作用。结论丹参可以通过抑制Hh信号通路中EVC2、Gli2的表达,从而对活化的HSCs产生抑制作用。

外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响

目的探讨外源表达持续活化型Gli2对小鼠星形胶质细胞生物学特性的影响。方法构建可表达持续活化型Gli2的慢病毒载体,包装慢病毒颗粒,继而感染小鼠星形胶质细胞,对其生物学特性的改变进行鉴定。结果研究发现,含有外源表达的持续活化型Gli2的小鼠星形胶质细胞在神经干细胞培养基中连续培养13 d后可获得形成细胞球的能力,且形成的细胞球与正常的小鼠神经球在形态上相近;对所形成的细胞球做免疫荧光染色,结果显示神经干细胞的特异性标志物Nestin呈阳性。结论在小鼠星形胶质细胞中外源表达持续活化型Gli2后可使其获得形成神经球样细胞球的能力。

秦川牛Gli2基因重组干扰腺病毒的构建

【目的】构建秦川牛醇溶蛋白2(Gli2)基因的重组干扰腺病毒,为研究Hh信号通路在秦川牛脂肪形成过程中的功能奠定基础。【方法】构建3条短发卡RNA(shRNA):shRNA-LY1、shRNA-LY2、shRNA-LY3,利用双荧光素酶报告系统检测其干扰效率。再用干扰效率较高的shRNA-LY3构建腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,转染HEK 293A细胞进行腺病毒的包装并扩繁以提高病毒滴度。利用LaSRT法测定腺病毒的滴度,并将得到的病毒以不同剂量侵染秦川牛脂肪细胞,确定其最佳感染复数(MOI)。【结果】筛选得到shRNA-LY3干扰效率最高,达到85%;成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体pAD/PL-DEST/CMV-GFP/U6-LY3,包装后获得了重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3;LaSRT法测得其滴度为1×10~9 PFU/mL。腺病毒对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。【结论】成功构建了秦川牛Gli2基因腺病毒干扰载体,包装后获得了高滴度的重组干扰腺病毒Ad-shRNA-LY3,其对秦川牛脂肪细胞的最佳MOI为50。

Gli2基因沉默逆转肝癌细胞系SMMC-7721的上皮间质转化

目的探讨胶质瘤相关癌基因同源蛋白2(Gli2)对肝癌细胞系SMMC-7721上皮间质转化(EMT)和侵袭能力的影响及机制。方法合成shRNA-Gli2、shRNA-NC病毒载体,实验设shRNA-Gli2组、shRNA-NC组和空白组,转染SMMC-7721细胞。用Transwell小室和细胞黏附实验观察细胞侵袭及黏附能力;用qRT-PCR和Western blot检测细胞间Gli2、E-cadherin、N-cadherin及vimentin基因和蛋白的表达。结果在不同肝癌细胞系中,随着肝癌细胞系侵袭能力的增强,Gli2的表达逐渐增高,shRNA-Gli2组与对照组相比侵袭能力降低,同种黏附能力增加,异种黏附能力降低(P<0.05)。shRNA-Gli2组与对照组相比,E-cadherin表达明显增高而N-cadherin和vimentin表达明显降低(P<0.05)。结论沉默Gli2的表达能够促进肝癌细胞SMMC-7721 EMT的反转,并降低其侵袭能力,机制可能与E-cadherin的上调和N-cadherin、vimentin的下调有关。

沉默Gli2基因对肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨沉默胶质瘤相关癌基因同源蛋白2基因(glioma associated oncogene homolog 2,Gli2)对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及其可能的作用机制。方法:以重组shRNA-Gli2慢病毒感染SMMC-7721细胞,筛选沉默效果最佳干扰序列。以携最佳干扰序列重组慢病毒感染SMMC-7721细胞为干扰组,shRNA-NC慢病毒感染SMMC-7721细胞为对照组,不作处理SMMC-7721细胞为空白组。采用CCK-8法与集落形成实验检测各组细胞的增殖活性,流式细胞术检测各组细胞凋亡率;用q PCR和Western blotting法检测各组细胞Gli2、cyclin D1、Bax和Bcl-2 mRNA及其蛋白质的表达。结果:重组慢病毒感染率约为90%,重组shRNA-Gli2-1慢病毒沉默效果最佳;干扰组SMMC-7721细胞Gli2 mRNA和蛋白质表达显著低于对照组与空白组(均P<0.05),而对照组与空白组之间Gli2 mRNA和蛋白质表达差异不显著(P>0.05)。干扰组SMMC-7721细胞的增殖和细胞集落形成数明显少于对照组和空白组(均P<0.05);干扰组SMMC-7721细胞凋亡率显著高于对照组和空白组(均P<0.01);干扰组SMMC-7721细胞cyclin D1及Bax mRNA和蛋白质表达显著低于对照组和空白组,而Bcl-2 mRNA和蛋白质表达则显著高于对照组和空白组(均P<0.05)。结论:沉默Gli2基因的表达能够抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡,其机制可能与cyclin D1、Bax的下调和Bcl-2上调有关。