海洋真菌链孢粘帚菌(Gliocladium catenulatum T31)抗肿瘤活性代谢产物

目的阐明海洋真菌链孢粘帚菌（Gliocladium catenulatum T31）的抗肿瘤活性次级代谢产物。方法摇床发酵培养生产菌T31,活性跟踪分离纯化T31发酵液中的活性单体化合物,并根据理化性质和光谱分析（ESI MS、UV、IR、NMR等）鉴定单体化合物结构;采用细胞形态镜检、MTT方法评价单体化合物对人类慢性髓性白血病K562细胞的抗肿瘤活性。结果从链孢粘帚菌（Gliocladium catenulatum T31）发酵液中分离并鉴定了7个单体化合物,分别为3个甾醇类化合物ergosta-5,7,22-triene-3β-ol（1）、ergosta-6,22-diene-3β-ol（2）、ergosterol peroxide（3）和四个蒽醌类化合物emodin（4）、citreorosein（5）、isorhodopti-lometrin（6）和lunatin（7）,化合物1-7对K562细胞显示不同程度的细胞增殖抑制活性,其中,化合物4-7对K562细胞的IC50分别为1.09、1.24、13.6和8.92μmol.L-1。结论海洋真菌链孢粘帚菌（Gliocladium catenulatumT31）的主要抗肿瘤活性次级代谢物是甾醇类和蒽醌类化合物。

核盘菌重寄生菌链孢粘帚霉HL-1-1菌株的生物学特性研究

对植物真菌病害优良生防菌株链孢粘帚霉 (Gliocladiumcatenulatum)HL 1 1的生物学特性进行了研究。结果表明 ,以核盘菌菌核粉为唯一碳源的培养基最适合HL 1 1的菌丝生长 ,PDA最适合产孢 ;蔗糖作为碳源、硝酸钾作为氮源、2 5 30℃、pH值 5及黑暗等条件适合HL 1 1的菌丝生长 ;可溶性淀粉作为碳源、牛肉膏作为氮源、2 5℃、pH值 6及光照等条件适合产孢 ;菌核浸出液对HL 1 1的分生孢子萌发有促进作用 ,葡萄糖对分生孢子萌发有抑制作用 ;2 5 30℃及黑暗条件适合孢子萌发 ,温度低于 5℃或高于 4 0℃ ,孢子不能萌发 ;孢子致死温度为 5

链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核相关基因的EST生物信息学分析

链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum是一种重要的菌寄生真菌,为了明确该菌与寄主核盘菌Sclerotinia sclerotiorum互作中参与菌寄生过程的功能基因,本实验室前期采用抑制消减杂交技术（SSH）构建了消减cD-NA文库。本文从该库里随机挑选420个阳性克隆进行测序分析,结果表明克隆片段大小在200~600bp的序列占81.07%。去除载体和小于100bp的序列,获得391条有效序列,其平均长度为409bp。通过序列拼接得到181个单值基因（unigenes）,其中包括27个重叠群（contigs）和154个单拷贝的ESTs（singletons）。将得到的ESTs与NCBI非冗余蛋白数据库（NR）进行BLASTx分析,结果显示有38个基因的编码蛋白与已知功能的蛋白有较高的相似性,其中包括可能与生物防治功能相关的内切葡聚糖酶、脂滴包被蛋白、MFS转运蛋白、过氧化物酶等;有39条序列在NCBI数据库中未找到相似序列,可能为新基因;其他基因的编码蛋白与数据库中功能未知蛋白相似性高。本研究为明确与重寄生功能相关的基因奠定了基础。

链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核差异表达基因的筛选及分析

为克隆和研究链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum寄生核盘菌菌核的相关基因，应用抑制消减杂交技术构建了cDNA消减文库并进行了筛选。通过PCR技术从文库中共筛选到1315个阳性克隆，克隆中插入片段大小主要集中于300～600bp之间。随机挑取120个克隆，经测序和同源性分析，获得60条有效序列，其中部分序列所编码的血红素加氧酶、核糖体蛋白L11、细胞色素P450及热激蛋白等均参与机体对胁迫条件的应答反应。11条序列在NCBI数据库中未找到显著匹配的序列，可能为新基因片段。分别将寄生于核盘菌菌核上的粘帚霉cDNA和粘帚霉与核盘菌纯培养的cDNA混合物经RasⅠ酶切后进行标记作为探针，利用反向Northern杂交技术验证了所选取的25条序列全部为差异表达基因片段。

链孢粘帚霉HL-1-1内切葡聚糖酶基因克隆及功能分析

为研究链孢粘帚霉Gliocladium catenulatum HL-1-1寄生核盘菌菌核的相关基因,从实验室前期构建的差异表达cDNA文库中随机挑选504个阳性克隆进行测序和比对分析,获得内切葡聚糖酶基因,并命名为eg8-20。该基因与木霉Trichoderma sp.SSL内切葡聚糖酶基因的同源性高达94%。采用RACE技术获得了eg8-20全长cDNA,该基因长度为1479 bp(GenBank登录号JQ728996),开放阅读框(ORF)长1269 bp,编码423个氨基酸。对HL-1-1菌株在菌核粉培养基中内切葡聚糖酶基因表达水平的定量监测结果表明,eg8-20表达水平随菌核诱导培养时间的延长而提高,96 h后表达量升高9倍。为进一步验证其功能,通过同源重组将G418抗性标记基因定点插入到链孢粘帚霉HL-1-1中,获得eg8-20缺失转化子ED-3。表型研究发现,基因敲除转化子的生长速度、产孢量与野生型无显著差异。室内生物测定表明,转化子能够抑制核盘菌菌核萌发,但其侵染能力明显减弱,寄生级别由野生型菌株的四级降为二级,证明内切葡聚糖酶在链孢粘帚霉寄生核盘菌菌核过程中发挥着重要的作用。