家蚕Gloverin 2克隆、高效表达及其抗核型多角体病毒感染作用研究

为获得家蚕抗菌肽葛佬素2(BmGloverin 2),并研究其在家蚕抗核型多角体病毒(BmNPV)感染过程中的作用,以经BmNPV诱导的3龄3日家蚕中肠cDNA为模板,根据GenBank上BmGloverin 2基因序列设计特异性引物,克隆出去除信号肽部分(1—18 aa)的BmGloverin 2基因,与表达载体pET-28a(+)连接构建pET28a(+)-BmGloverin 2,对含有pET28a(+)-BmGloverin 2重组质粒的菌株诱导表达,然后对抗菌肽重组蛋白进行Ni-IDA亲和层析、透析及浓缩过滤以获得高浓度目的蛋白;并采用抑菌试验检测BmGloverin 2重组蛋白生物活性;最后,将具有生物活性的BmGloverin 2重组蛋白和BmNPV混合处理4 h后喂食家蚕,并以直接喂食BmNPV和无菌水处理为对照组,以检测BmGloverin 2对BmNPV感染家蚕的影响。结果显示,成功克隆BmGloverin 2基因,并构建重组pET28a(+)-BmGloverin 2;在37℃、0.5 mmol/L IPTG条件下诱导表达可获得大量BmGloverin 2重组蛋白,经SDS-PAGE检测其分子质量为19.1 ku,与预期大小相符,经过纯化浓缩最终获得BmGloverin 2重组蛋白;抑菌试验证明,重组BmGloverin 2蛋白具有生物活性;与BmNPV对照组相比,饲喂重组BmGloverin 2蛋白与BmNPV混合液处理组幼虫存活率提高。可见,BmGloverin 2在家蚕抵抗BmNPV侵染中发挥作用。

昆虫抗菌肽Gloverins的进化及抗菌差异性的研究

本研究以抗菌肽Gloverins为研究对象,分析其抗性机理,并根据其编码区序列建立系统发育树,分析Gloverins的进化及结合生物信息学软件分析初步探索抗菌差异性产生的原因。结果表明:Gloverins与细菌或真菌表面的LPS,LTA,PG及昆布多糖相互作用是有效对抗微生物的必要条件。Gloverins的基因序列有一定的保守性,其中,玉米穗虫和棉铃虫同源性最高为98.4%,亲缘关系较近。家蚕中有4个完整的Gloverins基因,其中,Bm Glv1为其他3种同系物的祖先基因。大部分Gloverins对革兰阴性菌具有极强的杀灭作用,而甜菜夜蛾Gloverin(Se Glv)及烟草天蛾Gloverin(Ms Glv)由于其与Toll基因表达的依赖性,与LPS,LTA,PG和昆布多糖的结合位置,α-螺旋比例以及某些关键位点的氨基酸等因素,导致其对革兰氏阳性菌有抗菌活性,而对革兰阴性菌无活性的抗菌特性。

家蚕拟抗微生物肽Gloverins基因(Bmglv)的原核表达及抗菌活性鉴定

家蚕Bombyx mori基因组全测序于2004年完成后,由家蚕基因组注释发现了35条拟抗微生物肽基因序列。本研究选取其中的5条Gloverins同系物(isoforms)基因(BmglvB,BmglvA2,BmglvA3,BmglvA5和BmglvA6),克隆至pET-21d载体,转化Escherichia coli RosettaTM(DE3)宿主菌进行表达;克隆表达的5个家蚕Gloverins同系物基因大部分以可溶形式表达,经Ni-NTA亲和层析纯化和Sephadex G-10脱盐处理后,采用平板孔穴抑菌法测定其抗菌活性。结果表明:注释发现的5条家蚕拟抗微生物肽Gloverins同系物基因,具有与在其他昆虫中已鉴定报道的Gloverin相似的抗革兰氏阴性细菌的功能,实验确认了它们就是家蚕Gloverins抗微生物肽基因。

小菜蛾Gloverin like抗菌肽对蝉拟青霉侵染的响应研究

抗菌肽是昆虫天然免疫的重要成分,在抵御病原物的侵染中发挥着重要的作用。昆虫Gloverin抗菌肽是一类仅在鳞翅目昆虫中存在的富含甘氨酸抗菌肽。本研究在转录组测序的基础上对小菜蛾抗菌肽gloverin like基因进行了克隆,其开放阅读框序列全长519 bp,编码172 aa,信号肽为1-17 aa。序列分析表明其序列中甘氨酸的比例为15%,与鳞翅目昆虫Gloverin抗菌肽具有较高的同源性。qRT-PCR结果表明小菜蛾抗菌肽gloverin like基因在脂肪体和血细胞组织中表达量较高。蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌及大肠杆菌均可诱导小菜蛾抗菌肽gloverin like基因上调表达,蝉拟青霉诱导12 h后表达量达到最高。利用LC-MS方法在蝉拟青霉侵染的小菜蛾幼虫血淋巴中鉴定出小菜蛾Gloverin like、Gloverin抗菌肽以及Lysozyme II、Transferrin、Prophenoloxidase等抗菌效应蛋白。与对照相比,蝉拟青霉侵染后小菜蛾Toll通路4个免疫基因(βGBP、Toll、Cactus和Dorsal)表达量上升。本研究在抗菌肽方面为进一步研究小菜蛾抵御病原真菌入侵的分子机制提供基础信息,也为新的害虫防治方法提供了思路和靶标。

绿僵菌素A对家蚕cecropin B和gloverin 4基因表达的影响

绿僵菌素A(DA)是由金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae产生的一种环缩羧肽类次生化合物,具有抗昆虫免疫作用,但是人们对其影响免疫相关基因调控的机理缺乏了解。本实验以家蚕Bm12细胞为材料,采用RNAi技术沉默相关转录因子,结合荧光定量PCR(q PCR)技术,明确DA处理或沉默TOLL和IMD信号通路相关转录因子后抗菌肽cecropin B和gloverin 4基因表达的变化。实验发现,DA能引起抗菌肽cecropin B基因表达上调和gloverin 4基因表达下调。利用特异性siRNA分别沉默转录因子BmRelish1、BmRelish2、BmRel、Bm FOXg1后,发现只有沉默转录因子BmRelish时,cecropin B和gloverin 4基因表达才下调,说明这两种抗菌肽的合成均通过IMD信号通路调控。当沉默BmRelish1或BmRel基因及DA处理联合作用时,cecropin B基因显著下调,说明在抑制cecropin B合成时,DA与转录因子BmRelish1或者BmRel之间存在密切的协同效应;同样,在促进gloverin 4合成时,DA与转录因子BmRelish2之间也存在着协同效应。

抗菌多肽葛佬素的原核表达纯化及活性鉴定

目的 原核表达抗菌肽葛佬素,并对其生物学活性进行初步鉴定。方法 应用pET原核表达系统进行目的 蛋白的表达,应用蛋白免疫印迹对蛋白进行鉴定,并采用鲎试剂法,对表达产物的生物活性进行初步鉴定。结果 体外表 达产物经蛋白免疫印迹鉴定,为融合有聚组氨酸标签的葛佬素抗菌肽,鲎试剂检测结果表明,该表达产物对LPS有明显的 中和活性。结论 在原核表达系统中成功表达了具有生物活性的抗菌肽葛佬素。

利用RTS500系统进行抗菌肽葛佬素蛋白的体外表达

目的:构建含目的基因葛佬素(gloverin)的重组子并通过体外快速翻译系统RTS500(rapidtranslationsystem)对其进行表达。方法:采用PCR方法扩增葛佬素cDNA,将其与表达载体pIVEX2.3连接;采用PCR及双酶切方法鉴定连接产物。将含目的基因片段的阳性重组质粒通过体外表达翻译系统RTS500,使其蛋白能在大肠杆菌(E.coli)裂解产物中进行表达。应用蛋白免疫印迹方法对表达产物进行鉴定。结果:pIVEX2.3G重组表达质粒通过体外表达翻译系统RTS500可表达出分子量约为14.4的蛋白;蛋白免疫印迹证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白。结论:抗菌肽葛佬素可在体外大肠杆菌裂解产物中进行表达。

葛佬素的原核表达及其在牙髓细胞中的抗炎效应研究

目的:采用原核表达系统表达抗菌肽葛佬素,并观察其对原代牙髓细胞炎性细胞因子IL-1β分泌的影响。方法:应用pET原核表达系统进行目的蛋白的表达,应用蛋白免疫印迹对蛋白进行鉴定,并采用ELISA方法,观察重组葛佬素对内毒素诱导的牙髓细胞IL-1β释放的影响。结果:原核表达产物经蛋白免疫印迹鉴定,为融合有聚组氨酸标签的葛佬素抗菌肽,ELISA检测结果表明,该表达产物能够以剂量依赖方式抑制LPS诱导的IL-1β释放。结论:在原核表达系统中成功表达了具有生物活性的抗菌肽葛佬素,该表达产物可以抑制牙髓细胞炎性因子IL-1β的释放。

抗菌肽葛佬素在非洲绿猴肾细胞株COS-7中的表达及其活性的初步分析

目的 观察自行设计的葛佬素cDNA在非洲绿猴肾细胞株COS 7中的表达及其表达产物的抗菌作用。 方法 分析同种族蛋白质AttacinAcDNA序列各种遗传密码子的出现频度 ,结合已知的葛佬素蛋白质序列 ,设计、合成其cDNA序列。经测序验证后 ,将葛佬素基因插入真核细胞表达载体pCDSI中 ,构建载体pBZHG。随后以脂质体为载体 ,对COS 7细胞进行质粒pBZHG和空载体pCDSI的转染 ,72h后收集细胞培养上清液 ,进行杀菌活性的检测 (以正常COS 7细胞培养上清作对照 )。 结果 人工设计的葛佬素cDNA序列在COS 7中得到表达。与转染空载体的细胞和正常细胞比较 ,转染pBZHG的COS 7细胞培养上清对大肠杆菌J5具有杀菌活性。 结论 笔者所设计的葛佬素cDNA序列是正确的 ,由此可为深入研究葛佬素的抗菌及抗内毒素作用提供实验依据。