人糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及其活性研究

目的构建人糖皮质激素受体变异体表达载体,研究其表达和功能。方法运用RT-nested PCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD(ligand b ind ing dom ain)的cDNA序列,将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体,测序筛选重组质粒;荧光显微镜观察重组质粒转染表达情况;相对荧光素酶法检测GR转录激活活性。结果扩增出长1 601 bp的cDNA序列,测序证实:克隆片段与Genbank该基因序列同源性为100%;重组质粒表达产物定位于细胞核;转染组细胞转录激活活性增强。结论成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体,该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。

缺失激素结合区的人糖皮质激素受体突变体的研究

目的:构建缺失激素结合区(LBD)的人糖皮质激素受体突变体表达载体,并研究其表达和功能。方法:运用RT-nested PCR扩增人糖皮质激素受体(GR)基因不含编码LBD的cDNA序列,将PCR产物定向克隆至pEGFP-N2质粒载体,测序筛选编码正确的重组质粒;荧光显微镜观察GR突变体重组质粒转染人巨噬细胞株U937后的表达情况;相对荧光素酶法检测转染后细胞GR转录激活活性。结果:扩增出长1601 bp的cDNA序列,测序证实:克隆片段与Genebank该基因序列同源性为100%;重组质粒表达产物定位于细胞核;转染组细胞GR转录激活活性增强。结论:成功构建缺失LBD的GR突变体表达载体,该突变体具有不依赖激素的GR转录激活活性。

大鼠糖皮质激素受体变异体cDNA序列克隆和表达及功能研究

目的 :构建大鼠糖皮质激素受体变异体表达载体 ,研究其表达和功能。方法 :运用RT -nestedPCR扩增糖皮质激素受体不含有编码LBD结构域的cDNA序列 ,将PCR产物定向克隆至pEGFP -N2质粒载体 ,测序筛选重组质粒 ;荧光显微镜观察重组质粒转染后的表达情况 ;相对荧光素酶法检测转录激活活性。结果 :扩增出长 16 12bp的cDNA序列 ,测序证实 :克隆片段与Genebank该基因序列同源性为 10 0 % ;重组质粒表达产物定位于细胞核 ;转染组细胞转录激活活性增强。结论 :成功构建糖皮质激素受体变异体的表达载体 ,该变异体具有不依赖激素的转录激活活性。

PDT/GR-ΔLBD融合蛋白的表达、纯化及穿膜特性的鉴定

目的构建穿膜肽(PDT)和缺失结合配体结构域的小鼠糖皮质激素受体(GR-ΔLBD)融合基因表达载体,经原核表达、纯化后,进行穿膜特性的鉴定。方法质粒pEGFP-GR-ΔLBD经双酶切,获得目的基因片段GR-ΔLBD,将该基因片段亚克隆入原核表达载体pGEX-PDT,获得pGEX-PDT/GR-ΔLBD融合基因表达载体。将表达载体转化大肠杆菌,经IPTG诱导表达、谷胱甘肽-琼脂糖树脂处理、谷胱甘肽洗脱液洗脱后,获得PDT/GR-ΔLBD融合蛋白,SDS-PAGE分析融合蛋白;采用荧光素FITC体外标记PDT/GR-ΔLBD融合蛋白(终浓度分别为0、500、1000nmol/L),与小鼠肺上皮细胞TC-1共培养2h,在荧光显微镜下观察其穿膜特性。结果成功构建了融合基因原核表达载体pPDT/GR-ΔLBD,并能表达蛋白产物,大小约78.6kD,与融合蛋白PDT/GR-ΔLBD的理论计算值(80kD)相符。随着PDT/GR-ΔLBD浓度的增加,进入TC-1上皮细胞的PDT/GR-ΔLBD明显增多,并可在胞核中浓聚。结论 PDT/GR-ΔLBD融合蛋白具有良好的可溶性和穿膜特性,为进一步研究PDT/GR-ΔLBD融合蛋白在抗炎过程中的作用奠定了基础。

多发性硬化患者糖皮质激素受体和甲基强的松龙疗效的关系

目的比较复发-缓解型多发性硬化(RRMS)、继发-进展型多发性硬化(SPMS)患者激素冲击治疗前、中、后外周血单核细胞(PBMC)中糖皮质激素受体(GR)蛋白含量和健康对照组的差异及其与甲基强的松龙(MP)疗效的关系。方法采用放射配体结合法测定45例健康成人、30例RRMS和6例SPMS患者PBMC中GR蛋白含量;使用扩展残疾状态量表(EDSS)评价MP疗效。结果(1)治疗前RRMS和SPMS患者的GR蛋白含量分别为(3765.83±1053.24)位点/细胞和(1599.67±448.79)位点/细胞,均低于健康对照组[(4249.09±616.10)位点/细胞](P<0.05);治疗中,RRMS和SPMS患者的GR蛋白含量分别为(3127.57±970.06)位点/细胞和(1219.67±346.27)位点/细胞,两者较治疗前均有下调(P<0.05);治疗后RRMS患者的GR蛋白含量上升至(4487.20±1473.18)位点/细胞,与健康对照组差异无统计学意义(P>0.05),而SPMS患者的GR蛋白含量上升至(3115.50±868.83)位点/细胞,但仍低于健康对照组(P<0.05)。(2)RRMS患者治疗后EDSS降至(2.70±1.80)分,与治疗前的(3.97±1.76)分相比差异有统计学意义(P<0.05);SPMS患者治疗后EDSS为(6.25±2.73)分与治疗前的(6.92±1.93)分之间差异无统计学意义(P>0.05)。(3)RRMS患者治疗前、后GR蛋白含量与同时期EDSS评分之间呈明显线性负相关(P<0.05)。结论GR蛋白含量的降低可能与MS的发生和发展有关,MP冲击治疗中症状一过性加重与GR蛋白含量下降相关,RRMS患者GR蛋白含量与MP的疗效相关。

mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

目的 :克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA ,同时对其序列分析。方法 :采用RT PCR方法 ,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA ,克隆至pMD18 T载体 ,选择阳性克隆并进行序列测定。结果 :扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长 5 19bp ,编码 173个氨基酸残基 ,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论 :获得小鼠GITRL基因的克隆 ,为进一步研究其生物学功能提供基础。

CpGODN对哮喘小鼠肺组织GITR/GITRL表达的影响

目的观察CpGODN干预对哮喘小鼠肺组织GITR及GITRL表达的影响。方法 48只SPF级雄性BALB/c小鼠随机分为正常对照组(简称对照组),哮喘模型组(简称模型组),地塞米松治疗组,CpGODN治疗组。以卵清白蛋白(OVA)致敏和激发建立小鼠哮喘模型。观察肺组织病理;对支气管肺泡灌洗液(BALF)进行细胞分类及计数;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫组化检测肺组织中GITR、GITRL的表达。结果 BALF中嗜酸性粒细胞平均(x±s,下同)计数:CpGODN组为(2.76±0.25)×107/L,地塞米松组为(1.05±1.72)×107/L,均低于模型组的(12.09±2.62)×107/L,差异有统计学意义(P<0.01),CpGODN组与地塞米松组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR、免疫组化结果:CpGODN组与地塞米松组GITR、GITRL表达高于模型组,差异有统计学意义(P均<0.05),CpGODN组GITRL mRNA、GITR蛋白表达高于地塞米松组,差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析:肺组织GITR与GITRL表达呈正相关(P<0.01,n=40)。结论 CpGODN能改善哮喘小鼠气道炎症,显著增强哮喘小鼠模型中GITR及GITRL在肺组织中的表达。

GITRL对Kupffer细胞内脂多糖诱导的吲哚胺2,3双加氧酶的作用研究

目的:研究糖皮质激素诱导的TNF受体配体(GITRL)对Kupffer细胞(KCs)内脂多糖(LPS)诱导的吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)的影响。方法:分离小鼠KCs后分为5组:Control组,只加培养基;LPS组,加入LPS(10μg/ml);LPS+Control siRNA组,转染Control siRNA后同LPS组;LPS+GITRLsiRNA组,转染GITRLsiRNA后同LPS组;LPS+Dex组,地塞米松(100μmol/L)处理后同LPS组。处理24小时后,分别采用免疫细胞化学染色、蛋白免疫印记和ELISA法检测KCs的GITRL、IDO表达及肿瘤坏死因子(TNF)-α分泌。结果:和Control组比较,LPS刺激后KCs上GITRL的表达明显上调(P<0.05),而沉默GITRL基因或者使用地塞米松能减弱其升高(P<0.05)。LPS可以诱导IDO和TNF-α在KCs上的高表达,然而GITRL基因沉默可以抑制其诱导的IDO和TNF-α的表达(P<0.05),同样地塞米松预处理也能够减弱其诱导的IDO和TNF-α的表达(P<0.05)。结论:GITRL介导了KCs内LPS诱导的IDO,地塞米松可通过下调GITRL的表达以降低LPS诱导的IDO。

hGITRL_(aa52-177)蛋白在杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒系统表达hGITRLaa52-177蛋白。方法PCR扩增获得hGITRL胞外段(hGITRLaa52-177)基因,克隆入pFastBacHTa转移载体,在E.coliDH10Bac内通过转座子Tn7的介导,得到重组杆粒,转染Tn细胞表达目的蛋白。通过SDS-PAGE电泳及Westernblotting鉴定目的蛋白的表达。结果重组载体pFastBacHTa-hGITRLaa52-177以及重组杆粒Bacmid-hGITR-Laa52-177构建正确,在Tn细胞内成功表达6×His-hGITRLaa52-177重组蛋白,SDS-PAGE电泳及Westernblotting显示重组hGITRLaa52-177蛋白相对分子质量约为Mr18000。结论杆状病毒-昆虫表达系统获得hGITRLaa52-177蛋白,为进一步从蛋白质水平研究hGITR/hGITRL对机体免疫调节的影响奠定了基础。

重组基因酵母报道系统筛检GR效应物质

用糖皮质激素受体重组基因酵母报道系统对3种天然与4种合成的糖皮质激素的糖皮质激素受体(GR)效应进行测定.结果表明,天然糖皮质激素中,肾上腺酮的活性最高;而合成激素中甲基强的松的活性最强.这些物质的GR效应与物质的化学结构密切相关.天然和合成糖皮质激素的GR效应随各自的辛醇水分配系数的增加而增强.

结直肠癌组织中GITRL mRNA表达水平的检测及其临床意义

目的:建立检测人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(human glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor ligand,hGITRL)mRNA的实时荧光PCR方法,探讨hGITRL表达与结直肠癌发生发展的关系。方法:构建含hGITRL基因片段的标准质粒,通过实时荧光PCR检测20例结直肠癌组织与对应癌旁组织中GITRLmRNA的表达水平。结果:建立的hGITRLRT-PCR基因定量检测方法准确可靠(标准曲线相关系数为0.99983);在20例结直肠癌组织细胞中,GITRL表达水平较之对应的癌旁组织有所升高(P<0.05),且与肿瘤组织分型和临床分期存在相关性。结论:成功建立了检测hGITRLmRNA的实时荧光定量PCR方法,GITRL在结直肠癌组织细胞中表达量升高,且与癌症的严重程度呈现一定的相关性。

淫羊藿对激素性股骨头坏死骨组织OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的观察糖皮质激素对大鼠股骨头骨组织中骨保护素(OPG)/核因子kappa B受体活化因子配基(RANKL)mRNA表达的影响及淫羊藿的拮抗作用,探讨淫羊藿预防激素性股骨头坏死的作用效果及其作用机制。方法健康SD大鼠48只,雌雄各半,随机分为激素组、淫羊藿组和对照组,每组16只。激素组和淫羊藿组每只给予肌肉注射醋酸泼尼松龙12.5mg/kg,2次/周,淫羊藿组同时给予淫羊藿提取液1 ml/100 g(相当于0.1 g/ml生药)灌胃,而激素组用生理盐水代替淫羊藿灌胃,1次/d;对照组用生理盐水代替激素和淫羊藿以同样方式肌注和灌胃。4周后取左侧股骨头骨组织石蜡包埋,HE染色,鉴定股骨头坏死情况;取右侧股骨头骨组织提取总RNA,采用实时定量聚合酶链反应技术检测OPG和RANKLmRNA表达水平,计算出OPG/RANKL比值。结果激素组、淫羊藿组、对照组大鼠出现股骨头坏死表现比例分别为71.43%(10/14)、26.67%(4/15)、0(0/16);激素组、淫羊藿组、对照组OPG mRNA表达分别为1.13±0.32、1.47±0.42和1.51±0.43;RANKL mRNA表达分别为2.70±1.24、1.82±0.46和1.55±0.42。激素组OPG和OPG/RANKL比值低于淫羊藿和对照组,而RANKL表达高于淫羊藿组和对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。淫羊藿组与对照组比较,差异无统计学意义。结论淫羊藿预防激素性股骨头坏死可能与其拮抗皮质激素导致的OPG/RANKL mRNA表达异常有关。

人GITRL和IL-21基因对CML来源树突状细胞功能的影响

目的:本研究构建人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)联合白细胞介素21(IL-21)基因真核表达载体,为探讨目的基因对慢性粒细胞白血病(CML)来源树突状细胞(DC)的影响。方法:脂质体介导法将重组真核表达载体转染经纯化的伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC,流式细胞仪检测转染后DC的CD1а、CD83、CD86表达率变化。将转染后的DC与纯化的自体NK混合培养使之成为DC-CIK。以DC-CIK细胞为效应细胞,乳酸脱氢酶释放法观察其对靶细胞的杀伤率。结果:所获目的基因经测序与GenBank比对序列一致,真核表达载体质粒经限制性酶切鉴定片段大小正确,并均可转染至伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC细胞。经转染DC的CD1а、CD83、CD86表达率增加,细胞毒活性试验表明转染后的DC可增加自体NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结论:各组DC能够通过转染IL-21和GITRL基因的方式获得自我活化、上调自身细胞表面分子的表达,增强其对肿瘤细胞的细胞毒活性。

动脉粥样硬化大鼠颈总动脉糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体的表达及意义

目的:通过检测动脉粥样硬化大鼠颈总动脉中糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand,GITRL)的表达,探讨GITRL在动脉粥样硬化过程中的变化及意义。方法:建立大鼠动脉粥样硬化模型,取其颈总动脉,观察粥样硬化病变,采用免疫组织化学及蛋白质印迹(Western blotting)法检测GITRL的表达。结果:动脉粥样硬化大鼠颈总动脉的血管壁脂质沉积明显增多;弹性纤维不完整,连续性破坏、中断。动脉粥样硬化大鼠颈总动脉血管内GITRL的表达水平明显高于非动脉粥样硬化大鼠。结论:GITRL作为高脂饮食后表达上调的一种血管炎性分子,有望作为预测动脉粥样硬化发生的一种独立危险因素。

测定GITR和GITRLELISA的建立及其临床初步应用

目的建立测定糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR)及其配体(GITRL)的定量酶联免疫吸附试验(ELISA),并探讨GITR及GITRL定量测定在类风湿性关节炎(RA)及肿瘤疾病的诊断或病情监测中的临床应用。方法以鼠抗人GITR、GITRL单克隆抗体为包被抗体,以生物素-辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(SA-HRP)检测系统,建立GITR和GITRL定量检测的双抗体夹心ELISA。测定105例RA患者、54例肿瘤患者及100名健康体检者的血清GITR、GITRL含量,并探讨其与疾病的关系。结果建立的测定GITR、GITRL定量ELISA线性相关系数的平方(r2)分别为0.94和0.90。RA组血清中GITR、GITRL含量均明显高于正常对照组(P均<0.001);肿瘤组GITR高于正常对照组(P<0.001),GITRL与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论本研究成功建立了GITR、GITRL定量ELISA,血清GITR、GITRL含量测定可能会成为RA新的辅助性诊断指标和病情监测指标。

白血病、肾病患者糖皮质激素受体的放射分析及其临床意义

采用受体放射配体结合技术测定了 5 0例正常健康成人、18例健康儿童、5 0例急性淋巴细胞白血病 (ALL )患者和 33例肾病综合症 (NS)患者外周血淋巴细胞糖皮质激素高亲和力受体 GCRH 和低亲和力受体 GCRL 位点数 ,分析 GCR与疗效的关系 ;对 NS患者还检测了血浆 ACTH、皮质醇水平 ,探讨了 NS发病及疗效机制 ;同时还通过动物实验观察了中药名方小柴胡汤对应用 GC所产生的 GCR“降调节”效应的影响。结果表明 :AL L患者治疗前 GCRH>4 0 0 0位点 /细胞的患者对激素联合化疗疗效好 ,AL L患者在激素联合化疗后 GCRH 明显降调 ,但 GCRL 治疗前后无明显变化 ;NS患者治疗前 GCRH>6 0 0 0位点 /细胞的患者对 GC疗效好 ,GCRH<30 0 0位点 /细胞的患者对 GC治疗无效 ;所以对 AL L、NS患者疗前了解 GCR水平 ,有助于制定个体化的治疗措施。 SD大白鼠实验研究表明 ,小柴胡汤具有调控

GITRL联合IL-21基因真核表达载体的构建及体外研究

本研究构建人糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体配体(GITRL)联合白介素-21(IL-21)基因真核表达载体,为探讨目的基因对慢性髓系白血病(CML)来源树突状细胞(DC)的影响。应用脂质体介导法将重组真核表达载体转染至纯化的DC,而此纯化的DC来源于经伊马替尼治疗有效或无效的慢性期CML患者或健康志愿者。应用ELISA法检测转染后DC细胞因子的浓度变化。将转染后的DC与纯化的自体NK混合培养使之成为DC-CIK。以DC-CIK细胞为效应细胞,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对靶细胞的杀伤率。结果表明:所获目的基因经测序与GenBank比对序列一致,PCR及限制性核酸内切酶检测显示,真核表达载体质粒经限制性酶切鉴定片段大小正确,并均可转染至伊马替尼治疗有效、无效的慢性期CML患者及健康志愿者来源的DC细胞。成功转染相应载体后的DC分别表现出IL-2和IFN-γ分泌量增加;细胞毒活性试验表明,转染后的DC可增加自体NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结论:DC能够通过转染IL-21和GITRL基因的方式获得自我活化、上调自身细胞因子分泌的能力,为酪氨酸激酶抑制剂治疗无效的CML患者的免疫治疗奠定了理论依据和实验基础。

流式细胞仪用于荧光标记糖皮质激素受体的淋巴细胞研究

本文应用糖皮质激素受体(GR)的荧光素标记配体(DF)和流式细胞仪对正常人外周血淋巴细胞内的GR进行了研究。实验采用全血法和淋巴细胞分离法制备淋巴细胞,用相同的实验条件和信息处理进行比较,发现二种不同方法制备淋巴细胞对GR测定无明显影响。正常人外周血淋巴细胞阳性率为14.457±5.975。不同性别的GR淋巴细胞阳性率分别为,男性:18.128±6.3;女性11.058±2.984,有统计意义上的差别。

GITRL对肺癌移植瘤小鼠髓源性抑制细胞免疫抑制功能的调控及其分子机制

目的:研究糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体相关配体(glucocorticoid induced TNF receptor ligand,GITRL)对Lewis肺癌移植瘤小鼠来源的髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)免疫抑制功能的调控作用,并探究其分子机制。方法:采用C57BL/6小鼠构建Lewis肺癌移植瘤模型,分选荷瘤小鼠脾脏中MDSCs,采用流式细胞术检测其表面GITR的表达;GITRL(5μg/mL)处理MDSCs 48 h后,流式细胞术检测MDSCs对羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记的CD4+T细胞增殖的影响,比色法检测MDSCs胞内精氨酸酶1(arginase-1,Arg-1)的活性,Griess偶联法检测效应分子一氧化氮的释放量,并通过蛋白质印迹法检测MDSCs胞内信号分子的表达变化。结果:Lewis肺癌移植瘤小鼠脾脏中MDSCs表达GITR分子;与对照组相比,GITRL处理的MDSCs对CD4+T细胞增殖的抑制能力下降,Arg-1活性降低(P<0.05),一氧化氮释放量减少(P<0.01);GITRL蛋白下调了MDSCs胞内JAK2和STAT3(P<0.05或P<0.01)信号的磷酸化蛋白水平。结论:GITRL蛋白通过抑制MDSCs胞内JAK2/STAT3信号通路,下调MDSCs的免疫抑制功能。