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阻断肾素血管紧张素系统对长期高脂喂养胰岛素抵抗大鼠胰岛UCP2和GCLC表达的影响 被引量:1
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作者 李海玲 袁莉 +2 位作者 李新 李进 程梭梭 《中国病理生理杂志》 CAS CSCD 北大核心 2009年第10期1995-1999,共5页
目的:观察长期高脂喂养的胰岛素抵抗大鼠胰岛氧化应激机制以及阻断肾素血管紧张素系统(RAS)对其的影响,探讨RAS与氧化应激、糖代谢之间的关系。方法:雄性Wistar大鼠分为正常饲养组(NC组)、高脂饲养组(HF组)、高脂+培哚普利组(FP组)、高... 目的:观察长期高脂喂养的胰岛素抵抗大鼠胰岛氧化应激机制以及阻断肾素血管紧张素系统(RAS)对其的影响,探讨RAS与氧化应激、糖代谢之间的关系。方法:雄性Wistar大鼠分为正常饲养组(NC组)、高脂饲养组(HF组)、高脂+培哚普利组(FP组)、高脂+替米沙坦组(FM组),后2组大鼠喂养16周后分别以培哚普利2mg·kg-1.d-1(FP组,n=15)和替米沙坦10mg·kg-1.d-1(FM组,n=15)干预,8周后行正常血糖高胰岛素钳夹试验评估外周胰岛素抵抗程度,行静脉葡萄糖耐量试验检测胰岛β细胞功能,以RT-PCR检测γ谷氨酰半胱氨酸连接酶的催化亚基(GCLC)的表达,以免疫组化法检测胰岛局部线粒体解偶联蛋白2(UCP2)水平,以比色法测定胰腺组织丙二醛(MDA)的含量。结果:与正常饲养组相比,高脂饲养组的葡萄糖输注率(GIR)降低了31.8%,胰岛GCLC表达降低了31.5%,局部UCP2相对浓度增加了17.0%,胰腺MDA含量增加了0.46倍(均P<0.01),0-10min胰岛素曲线下面积(AUC10-10)为(271.8±33.8)vs(282.7±29.8)mIU.L-1.min-1,糖刺激后早期胰岛素分泌降低,但无显著差异;培哚普利或替米沙坦干预后,GIR分别增加了27.8%和30.8%,胰岛GCLC表达分别增加了26.6%和26.6%,局部UCP2相对浓度分别下降了13.0%和15.6%,胰腺MDA含量分别下降了18%和20%(均P<0.01),FP、FM组之间无显著差异。结论:阻断RAS可以改善高脂喂养大鼠的胰岛素抵抗和胰岛β细胞分泌功能,其机制可能为通过下调胰岛局部UCP2和上调GCLC的表达,减轻氧化应激损伤,从而保护胰岛β细胞功能。 展开更多
关键词 肾素-血管紧张素系统 胰岛素抵抗 解偶联蛋白2 谷氨酰半胱氨酸连接酶的催化亚基
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转录因子上游刺激因子在大鼠不同组织中的分布 被引量:2
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作者 邹东霆 李冰 +3 位作者 付欣 洪玮 周问渠 冉丕鑫 《广州医学院学报》 2010年第3期28-30,共3页
目的:探讨转录因子上游刺激因子(USF)在大鼠不同正常组织中的分布情况.方法:使用大鼠多种组织构成的组织芯片,免疫组织化学检测USF1、USF2在各组织及其细胞中的表达.结果:USF是体内广泛分布的转录因子,除血管内皮、肾小球细胞外在... 目的:探讨转录因子上游刺激因子(USF)在大鼠不同正常组织中的分布情况.方法:使用大鼠多种组织构成的组织芯片,免疫组织化学检测USF1、USF2在各组织及其细胞中的表达.结果:USF是体内广泛分布的转录因子,除血管内皮、肾小球细胞外在大多数上皮细胞有强的表达.在肌肉组织主要表达于骨骼肌和心肌组织,平滑肌则只有USF2表达;结缔组织中,表达阴性或弱阳性;在卵巢组织中,USF1在发育卵泡和闭锁卵泡均为强阳性表达,USF2则在闭锁卵泡中,强阳性表达,在发育卵泡则表达较弱.结论:USF是大鼠体内广泛分布的转录因子,可能参与调控一般细胞生理活动的基因表达. 展开更多
关键词 转录因子 上游刺激因子 免疫组织化学 谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚单位 大鼠
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外周T细胞淋巴瘤组织中GCLC和GCLM的表达及其临床意义 被引量:3
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作者 党春艳 薛丽 +2 位作者 马淑萍 蒙玉娜 李红玲 《现代肿瘤医学》 CAS 2020年第10期1726-1730,共5页
目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的... 目的:探讨外周T细胞淋巴瘤(PTCL)组织中谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)的表达及其临床意义。方法:采用免疫组织化学法检测40例PTCL患者组织标本及20例淋巴结反应性增生组织中GCLC和GCLM的表达情况,分析其表达与PTCL患者临床病理特征的关系。结果:GCLC在PTCL组织中的阳性表达率为32.5%(13/40),在淋巴结反应性增生组织中未见明显表达,差异显著(P<0.05)。PTCL组织中GCLM的阳性表达率为35.0%(14/40),高于淋巴结反应性增生组织的10.0%,差异显著(P<0.05)。GCLC和GCLM的表达与PTCL患者的Ann-Arbor临床分期、B症状、国际预后指数(IPI)密切相关(P<0.05),但与患者的年龄、性别、乳酸脱氢酶(LDH)水平、骨髓侵犯均无关(P>0.05),且分期越晚(Ⅲ+Ⅳ期)、IPI(3~5分)越高者,GCLC和GCLM的阳性表达率越高。Spearman等级相关分析显示,PTCL组织中GCLC蛋白与GCLM蛋白的表达呈正相关。结论:GCLC和GCLM在PTCL组织中高表达,可能参与肿瘤的发生和发展,有望为PTCL的病因学研究及治疗提供理论依据。 展开更多
关键词 外周T细胞淋巴瘤(PTCL) 谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC) 谷氨酸-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM) 免疫组织化学 临床意义
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GCLC基因上游AHR/ARNT元件负性调控GCLC基因在大鼠支气管上皮细胞的表达 被引量:1
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作者 赖宁 李冰 +3 位作者 王健 付欣 洪玮 冉丕鑫 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2009年第5期429-435,共7页
研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含... 研究谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因上游调控序列中2个AHR/ARNT元件的功能,从而了解γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因转录调节特征.分别构建缺失2个位点AHR/ARNT元件的GCLC基因上游近端序列的萤光素酶报道基因载体以及含有2个AHR/ARNT元件核心序列的萤光素酶报道基因载体.转染大鼠支气管上皮细胞(RTE),比较检测野生与缺失报道载体的基因转录调控效率;利用电泳迁移率变动实验(EMSA)和超级迁移率变动实验检测AHR/ARNT元件与AHR以及ARNT因子的特异性结合;通过转染AHR因子真核表达质粒进一步确定AHR/ARNT元件与AHR结合在GCLC基因表达中的最终作用.结果显示,相比其野生序列,缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)和双缺失AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085,-215^-210)的GCLC上游调控序列报道载体在RTE显著提高萤光素酶表达(均P<0.05),而缺失AHR/ARNT元件(-215^-210)则未见显著影响(P>0.05);独立AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)具有转录促进作用(P<0.05)而独立AHR/ARNT元件(-215^-210)无明显影响(P>0.05).转染CMV2-AHR能够抑制野生型和缺失型报道载体的萤光素酶表达(P<0.05).EMSA证实GCLC基因上游调控区域的2个AHR/ARNT元件均有核蛋白结合,并且超级迁移率变动实验显示结合的蛋白主要含有转录因子AHR以及ARNT.因此,2个AHR/ARNT元件均可以与异源二聚体AHR/ARNT结合,AHR/ARNT元件(-1 090^-1 085)是GCLC基因中重要的抑制元件. 展开更多
关键词 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC) 转录调控 AHR/ARNT元件 大鼠支气管上皮细胞(RTE)
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转录因子DEC1和DEC2通过Ebox元件下调大鼠Gclc基因的表达 被引量:1
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作者 黄楚琴 周问渠 +3 位作者 付欣 洪玮 蔡磊 李冰 《中国生物化学与分子生物学报》 CAS CSCD 北大核心 2013年第6期585-590,共6页
为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853~-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L... 为研究Ebox元件在谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate-cysteine ligase catalyticsubunit,GCLC)基因表达中的地位,构建含Gclc上游5.9 kb调控序列,及突变Ebox(-3 853~-3 848)的萤火虫荧光素酶报道载体.转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2),比较野生与突变报道载体的转录活性.共转染野生型载体与转录因子分化型胚胎软骨发育基因1/2(differentiated embryochondrocyte expressed gene1/2,DEC1/2)真核表达载体,检测DEC1/2对Gclc转录活性的影响;电泳迁移率(electrophoretic mobility shift assays,EMSA)和超级迁移率实验(supershift assay)检测Ebox元件是否与DEC1/2特异结合.蛋白免疫印迹技术检测Dec1/2过表达对Gclc表达的影响.结果显示,载体构建符合预期;突变Ebox元件可显著上调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);共转染DEC1/2表达载体显著下调Gclc荧光素酶活性(P<0.01);EMSA证实Ebox元件(-3 853~-3 848)与核蛋白结合,且特异性强;超级迁移率显示,结合的核蛋白有转录因子DEC1、DEC2;Western印迹结果显示,DEC1/2的表达明显下调Gclc的内源性表达.结果提示,转录因子DEC1与DEC2具有Gclc表达抑制活性,可能与Ebox(-3 853~-3 848)有关. 展开更多
关键词 谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC) 分化型胚胎软骨发育基因1 2 Ebox元件 大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2)
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高氧暴露对早产鼠肺组织HO-1和GCLC表达的影响 被引量:1
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作者 楚晓云 蔡成 +3 位作者 张潇月 周慧琳 孙俊芳 翁博雯 《中国当代儿科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2019年第6期594-600,共7页
目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常... 目的 探讨高浓度氧暴露对新生早产大鼠肺组织中血红素加氧酶-1(HO-1)和谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位(GCLC)动态表达的影响。方法 受孕21d大鼠行剖宫产取出早产鼠80只,喂养1d后随机分为空气组和高氧组。空气组早产鼠放置在室内常压空气中饲养,高氧组早产鼠放置在同一室内常压氧箱中(氧浓度85%~95%)饲养,分别于第1、4、7、10、14天,每组取8只大鼠,采集两组早产鼠肺组织标本。采用苏木精-伊红染色法检测两组早产鼠不同时间点肺组织结构的病理变化;采用Westernblot技术和RTqPCR检测两组早产鼠不同时间点肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化。结果 与空气组相比,高氧组早产鼠体重下降显著(P<0.05)。与空气组相比,高氧组早产鼠肺组织病理切片显示肺组织结构紊乱、肺泡间隔增宽、肺泡数目减少和肺泡简单化。高氧组早产鼠肺组织中HO-1mRNA相对表达量在第7天时低于空气组,在第10、14天时高于空气组(P<0.05)。高氧组早产鼠肺组织中GCLCmRNA表达量在第1、4、7天时低于空气组,在第10天时高于空气组(P<0.05)。与空气组比较,高氧组早产鼠肺组织中HO-1蛋白表达水平在各时间点均升高;除第1天外,GCLC蛋白表达水平在其他各时间点均升高(P<0.05)。结论 高氧暴露导致早产鼠生长发育迟缓、肺发育阻滞。早产鼠肺组织HO-1和GCLC蛋白及mRNA的表达变化可能与高氧暴露导致早产鼠肺损伤发病过程相关。 展开更多
关键词 高浓度氧 血红素加氧酶-1 谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶催化亚单位 早产 大鼠
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PPARA参与肝细胞癌发生铁死亡预防疾病恶化的初步研究
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作者 蔡佳佳 梁敏婷 +3 位作者 李婉晴 张卫云 李晓 孙朝晖 《中华预防医学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2023年第7期1068-1074,共7页
本研究通过在线公共数据库与细胞实验分析过氧化物酶体增殖物激活受体a(peroxisome proliferator-activated receptor a,PPARA)在肝细胞癌中的表达情况、基因功能及对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者疾病恶化的影响,探讨PP... 本研究通过在线公共数据库与细胞实验分析过氧化物酶体增殖物激活受体a(peroxisome proliferator-activated receptor a,PPARA)在肝细胞癌中的表达情况、基因功能及对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者疾病恶化的影响,探讨PPARA是否参与肝细胞癌铁死亡的过程。采用实验性研究,基于生物信息学的数据分析及细胞实验,2022年1至8月在我院基础医学实验室进行相关细胞实验。利用癌症基因组数据(The Cancer Genome Atlas,TCGA)和基因表达数集(Gene Expression Omnibus,GEO)数据库分析PPARA在肝细胞癌中表达水平及与患者临床病理特征相关性。通过人类蛋白免疫组化表达数据库(The Human Protein Atlas,HPA)研究PPARA在HCC肿瘤组织及正常组织中蛋白表达情况。基于基因、蛋白质相互作用关系检索工具(Search Tool for the Retrival of Interacting Genes/Protein,STRING)数据库构建PPARA与铁死亡关键因子的蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,同时用基因表达谱数据动态分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA)分析PPARA与关键基因谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位(Glutamate-Cysteine Ligase Catalytic Subunit,GCLC)的相关性。通过免疫印迹(Western Blot,WB)检测HCC细胞株SK-HEP-1、SMMC-7721、MHCC-97H、BEL-7402及正常肝细胞L02中PPARA的表达水平,观察用铁死亡诱导剂Erastin处理48 h后PPARA表达量的变化。GEPIA数据库中各组间PPARA表达量间比较使用单因素方差分析方法。GSE25097与GSE112790数据集中PPARA的表达量比较采用秩和检验。生存分析使用时序检验方法进行统计。比较不同临床、病理特征间PPARA表达量间的差异利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验。利用斯皮尔曼相关系数的方法比较GCLC与PPARA表达量之间的相关性。利用配对T检验对PPARA在细胞系中表达量进行比较。结果显示,HCC组织中PPARA的RNA水平和蛋白表达水平均低于正常组织(P<0.05)。PPARA表达水平与临床病理分级和预后有关(P<0.05)。STRING数据库构建的PPI提示PPARA与铁死亡关键因子NFE2样bZIP转录因子2(NFE2 like bZIP transcription factor 2,NFE2L2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、肿瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、GCLC、二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4,DPP4)、柠檬酸合成酶(citrate synthase,CS)、花生四烯酸15脂氧合酶(arachidonate 15-lipoxygenase,ALOX15)、酰基CoA合成酶长链家族成员4(Acyl-CoA synthetase long chain family member 4,ACSL4)等存在相互作用。进一步研究表明,GEPIA数据库结果显示PPARA与GCLC的表达呈正相关(R=0.6,P<0.05)。用铁死亡诱导剂Erastin处理MHCC-97H和SK-HEP-1细胞48 h后,通过WB检测发现PPARA表达量均升高。综上,PPARA在HCC低表达,表达量越低则患者生存期越短。PPARA与GCLC相互作用,从而共同参与调控HCC铁死亡过程。 展开更多
关键词 铁死亡 肝肿瘤 肝细胞 过氧化物酶体增殖物激活受体a 关键基因谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚单位
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体重指数与谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基基因多态性的交互作用对女性乳腺癌风险的影响 被引量:2
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作者 林威 唐录英 +4 位作者 岑玉玲 林颖 苏逢锡 贾卫华 任泽舫 《中华流行病学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第11期1115-1119,共5页
目的 探讨谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基(GCLC)rs17883901多态性位点对BMI与乳腺癌关联的影响.方法 于2008年10月至2010年6月对中山大学3所附属医院新诊断的839例乳腺癌患者(病例组)在接受治疗前及同时期863名年龄频数匹配的对照(... 目的 探讨谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基(GCLC)rs17883901多态性位点对BMI与乳腺癌关联的影响.方法 于2008年10月至2010年6月对中山大学3所附属医院新诊断的839例乳腺癌患者(病例组)在接受治疗前及同时期863名年龄频数匹配的对照(对照组)进行问卷调查和收集血样;采用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS),在Sequenom平台检测rs17883901位点基因型;采用非条件logistic回归分析计算BMI和GCLC与乳腺癌关联的OR值及其95%CI.结果 (1)病例组和对照组接受调查时当前的BMI、20岁时的BMI和GCLCrs17883901位点分布的差异均无统计学意义(P=0.44、0.52和0.47);(2)未发现当前的BMI与绝经前及绝经后乳腺癌风险相关,20岁时BMI为18.5~22.9 kg/m2可降低绝经前乳腺癌风险(OR=0.69,95%CI:0.48~1.00),而未发现其与绝经后乳腺癌风险相关;(3)在GCLC rs17883901位点突变型CT/TT人群中,当前的BMI≥25 kg/m2显著增加乳腺癌风险(OR=1.91,95%CI:1.09~ 3.36),而20岁时BMI为18.5 ~ 22.9 kg/m2与降低乳腺癌风险有关(OR=0.56,95%CI:0.31 ~ 0.99).当前的BMI与GCLC基因多态性对乳腺癌发生风险存在交互作用(P=0.043),而20岁时的BMI与GCLC交互项无统计学意义(P=0.15).结论 20岁时增加BMI可能是绝经前乳腺癌的保护因素;GCLCrs17883901位点本身与乳腺癌发生风险无显著关联,但其变异基因型可使当前的肥胖状态(BMI≥25 kg/m2)显著增加乳腺癌发生风险. 展开更多
关键词 乳腺癌 体重指数 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚基
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S-腺苷甲硫氨酸对Aβ抑制谷胱甘肽生成的影响
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作者 刘敏 崔静 李良 《神经疾病与精神卫生》 2016年第6期635-639,共5页
目的研究S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对β-淀粉样肽(Aβ)抑制谷胱甘肽(GSH)生成的影响。方法培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人胶质瘤细胞系(U87),分为对照组、SAM处理组、Aβ处理组、Aβ+SAM组,用Western blot方法检测谷酰胺-... 目的研究S-腺苷甲硫氨酸(SAM)对β-淀粉样肽(Aβ)抑制谷胱甘肽(GSH)生成的影响。方法培养人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人胶质瘤细胞系(U87),分为对照组、SAM处理组、Aβ处理组、Aβ+SAM组,用Western blot方法检测谷酰胺-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)、谷酰胺-半胱氨酸连接酶调节亚基(GCLM)和谷胱甘肽合成酶(GS)的蛋白表达量,实时定量PCR方法检测GCLC和GCLM mRNA表达量,用GSH试剂盒检测细胞GSH的含量。结果SH-SY5Y细胞和U87细胞经Aβ1-42处理后,GSH含量降低,合成过程中的催化酶GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量均下降,SAM干预后,GSH含量增加,GCLC、GCLM和GS的mRNA和相应蛋白表达量增高。结论SAM可通过增加GCLC、GCLM及GS的表达,提高GSH的含量,抑制Aβ诱导的氧化应激损伤,发挥保护作用。 展开更多
关键词 S-腺苷甲硫氨酸 谷胱甘肽 Β-淀粉样肽 谷酰胺-半胱氨酸连接酶催化亚基 谷酰胺-半胱氨酸连接酶调节亚基
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慢病毒介导的稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基基因的WRL68细胞株构建 被引量:2
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作者 范誉 农清清 +5 位作者 廖娟 胡新梅 朱雪凤 李江恒 郭尧平 陆继培 《环境与健康杂志》 CAS 北大核心 2015年第10期903-907,F0003,共6页
目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细... 目的利用慢病毒载体构建稳定过表达人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)的WRL68细胞株。方法采用PCR方法合成GCLC基因全长,经Not I、Nsi I酶切后克隆到慢病毒载体LV6上;采用PCR、酶切、测序鉴定重组质粒LV6-GCLC;将重组质粒转染293T细胞,收集培养上清并感染WRL68细胞,经嘌呤霉素筛选出稳定过表达细胞株。采用增强型绿色荧光蛋白检测转染情况,采用Real-time PCR及Western blotting鉴定所构建的细胞株;MTT法检测细胞活性;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测细胞谷胱甘肽(GSH)含量。结果 PCR、酶切及测序结果表明重组慢病毒载体构建成功;重组慢病毒转染293T细胞后可观察到荧光及蛋白表达,包装过表达慢病毒并检测其浓缩滴度为1.0×109 TU/ml;用1μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳定过表达细胞株;GCLC过表达组中GCLC的m RNA和蛋白的表达量高于空载体转染组及对照组(P<0.05);GCLC过表达组、空载体转染组及对照组的细胞活性间比较,差异无统计学意义(P>0.05);GCLC过表达组GSH含量明显高于空载体转染组及对照组(P<0.05)。结论成功构建了稳定过表达人GCLC的WRL68细胞株。 展开更多
关键词 慢病毒载体 GCLC 过表达 WRL68细胞
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双氢青蒿素对HepG2细胞氧化损伤和能量代谢的影响及其与索拉非尼的协同作用 被引量:1
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作者 崔钊 李硕 +7 位作者 王华晶 马冀 秦婷婷 石航 李兰芳 于桂花 李沧海 姜廷良 《中国实验方剂学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2021年第12期24-32,共9页
目的:探讨双氢青蒿素(DHA)对HepG2细胞的增殖抑制作用,通过细胞氧化损伤及能量代谢交互通路的影响阐明其作用机制;并通过与索拉非尼(Sora)联用,探讨其联合用药的可能性。方法:选用HepG2细胞和SW480细胞,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法分... 目的:探讨双氢青蒿素(DHA)对HepG2细胞的增殖抑制作用,通过细胞氧化损伤及能量代谢交互通路的影响阐明其作用机制;并通过与索拉非尼(Sora)联用,探讨其联合用药的可能性。方法:选用HepG2细胞和SW480细胞,细胞增殖与活性检测(CCK-8)法分别得到DHA与Sora的半数抑制浓度(IC50);Chou-Talalay法分析DHA与Sora联用的联用指数(CI)。选用HepG2细胞,分为正常组,DHA单用组(10μmol·L^(-1)),Sora单用组(5μmol·L^(-1))和DHA与Sora联用组(DHA 10μmol·L^(-1),Sora 5μmol·L^(-1)),药物孵育8~12 h后,糖酵解速率试剂盒检测细胞糖酵解功能,线粒体压力试剂盒检测线粒体氧化磷酸化功能;DCFH-DA活性氧(ROS)探针检测细胞内ROS水平变化;脂质过氧化物丙二醛(MDA)检测试剂盒检测细胞内MDA水平变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞内血红素氧合酶1(HO-1)和谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)蛋白的水平变化。结果:与正常组比较,DHA单用组能够显著抑制HepG2细胞的线粒体氧化磷酸化ATP合成能力和糖酵解速率(P<0.01),升高细胞内ROS和MDA水平(P<0.05),降低HO-1,GCLC水平(P<0.05);DHA与Sora联用在HepG2和SW480细胞中均具有较好的协同抑制细胞增殖作用,其CI值<0.9;与DHA单用组比较,DHA与Sora联用组对HepG2细胞的线粒体氧化磷酸化ATP合成和糖酵解的抑制程度均显著增强(P<0.01);细胞内的ROS和MDA水平均显著升高(P<0.01);细胞内抗氧化相关蛋白HO-1,GCLC水平均显著降低(P<0.01)。结论:DHA可能通过降低HepG2细胞内的HO-1,GCLC水平,升高ROS使MDA水平增加,并造成细胞线粒体氧化损伤,抑制细胞糖酵解能力以及氧化磷酸化能力,从而抑制HepG2细胞增殖;DHA与Sora联用具有协同抑制HepG2细胞增殖的作用,其机制可能与协同造成细胞氧化损伤从而影响线粒体电子传递链,抑制细胞能量代谢有关。 展开更多
关键词 双氢青蒿素 索拉非尼 协同作用 有氧糖酵解 线粒体氧化磷酸化 活性氧(ROS) 血红素氧合酶1(HO-1) 谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)
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稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因细胞株的建立
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作者 黄楚琴 周问渠 +3 位作者 蔡磊 洪玮 付欣 李冰 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第7期1225-1228,共4页
目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选... 目的:建立稳定表达大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)启动子及荧光素酶报告基因的大鼠肺泡上皮细胞株。方法:克隆大鼠GCLC上游5.9kb的启动子序列并构建重组报道载体PGL4.19-GCLC-LUC,转染到大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞L2,经G418筛选以获得单细胞抗性克隆并在传代过程中能稳定表达荧光素酶活性;检测细胞荧光素酶表达与细胞数量相关性;PCR检测稳定细胞株基因组已整合的插入片段;刺激因子刺激6h,检测稳定细胞株的反应性。结果:成功构建PGL4.19-GCLC-LUC;构建的稳定细胞株能稳定地表达荧光素酶,且与细胞数量正相关;PCR检测稳定细胞株目的片段稳定整合基因组;TNF-α刺激后,能使荧光素酶活性上升,差异有统计学意义(P<0.05);Rapamycin,GSH-EE刺激后,荧光素酶活性显著下降(P<0.05)。结论:成功构建稳定表达大鼠GCLC启动子及荧光素酶报告基因的细胞株,将为高通量药物筛选以及进一步研究GCLC基因的转录调控提供重要的细胞研究手段。 展开更多
关键词 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC) 启动子 荧光素酶报告基因 稳定细胞株
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β萘黄酮对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位基因表达的影响
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作者 崔力军 洪玮 +2 位作者 付欣 冉丕鑫 李冰 《中华生物医学工程杂志》 CAS 2010年第3期177-182,共6页
目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮(β-NF)对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因转录的影响,研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ—GCS)基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer... 目的通过了解外界刺激因子β萘黄酮(β-NF)对大鼠谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(GCLC)基因转录的影响,研究大鼠γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ—GCS)基因转录的调节机制。方法利用大鼠GCLC基因调控序列驱动的GCLC—PGL3-enhancer—Luciferase报道载体(GCLC—Luc)转染大鼠支气管上皮细胞(RTE)和肝癌细胞(H4ⅡE),分DMSO空白对照组和不同浓度的各刺激因子组,比较各组荧光素酶值的差异以筛选影响GCLC基因转录调控的刺激因子,并比较筛选到的刺激因子β—NF对GCLC—Luc在RTE和H4ⅡE细胞内表达影响的异同。2种转染后的细胞均分为β—NF实验组(10μmol/L)和DMSO空白对照组,以荧光定量PCR检测各组的细胞内源性γ—GCS转录水平变化。分别将构建的r系列缺失报道载体、GCLC—Luc和激活蛋白1(AP-1)、NF—κB定点突变报道载体转染2种细胞,分β-NF实验组(10μmol/L)与DMSO空白对照组,比较各组荧光素酶值的变化,分析B—NF作用的调节位点和转录调控作用相关元件。结果1、10、100μmol/L的β—NF均强烈抑制RTE中GCLC基因表达,荧光素酶值显著低于DMSO空白对照组(161354-1456、27524-218、15794-294比259714-1662,均P〈0.01)。在H4ⅡE中,1、10、100μmol/L的B—NF则促进其表达,荧光素酶值显著高于DMSO空白对照组(5686±441、13601±746、13978±164比3645±367,均P〈0.01)。荧光定量PCR显示10μmol/L的β-NF作用下,RTE内源性γ—GCS的mRNA表达水平是DMSO空白对照组的0.73倍,在H4ⅡE细胞中则是1.98倍。GCLC—Luc、r系列缺失报道载体转染2种细胞后,RTE中各载体β—NF实验组荧光素酶值均低于DMSO空白对照组(P〈0.01),而H4ⅡE中则高于DMSO空白对照组(P〈0.05)。β-NF作用的调节位点定位于转录起始位点上游-390~+2bp范嗣内。用针对该区域的AP-1、NF-κB定点突变报道载体转染细胞后,转染GCLC—Lue载体的B—NF实验组RTE荧光素酶值较DMSO空白对照组下降(91.50±0.32)%,与之相比,转染AP-1、NF-κB定点突变报道载体的细胞下降幅度并没有减少(P〉0.05)。在H4ⅡE,β—NF作用下转染GCLC—Lue载体的细胞荧光素酶值上升幅度则高于转染AP-1定点突变报道载体的细胞[(3.81±0.19)倍比(2.08±0.19)倍,P〈0.05],而与转染NF—κB定点突变报道载体的细胞荧光素酶值上升幅度[(4.41±1.01)倍]相比差异无统计学意义(P〉0.05)。结论在大鼠RTE和H4ⅡE,β—NF影响GCLC基因的表达具有细胞特异性。在大鼠H4ⅡE,β—NF通过激活抗氧化应答元件(ARE)类似的AP-1调控GCLC基因表达。 展开更多
关键词 β萘黄酮 谷氨酸-半胱氨酸连接酶 谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位 谷胱甘肽 细胞特异性
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大鼠GCLC基因5’-上游调控区域(-876~+1)的3个E-box元件功能分析
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作者 蔡磊 黄楚琴 李冰 《现代生物医学进展》 CAS 2014年第29期5601-5604,共4页
目的:GCLC基因表达调控有助于在分子水平了解GSH变化的机制,对进一步探索机体抗氧化失衡的机制有重要意义。本实验主要研究GCLC基因上游调控区域(-876^+1)三个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录作用机制。方法:利用PCR... 目的:GCLC基因表达调控有助于在分子水平了解GSH变化的机制,对进一步探索机体抗氧化失衡的机制有重要意义。本实验主要研究GCLC基因上游调控区域(-876^+1)三个相邻E-box元件的作用及探讨E-box元件组合的基因转录作用机制。方法:利用PCR定点缺失法构建多种组合的缺失E-box元件的GCLC上游启动子序列的报告基因载体。将所构建的载体在脂质体介导下瞬时转染大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2细胞),通过比较转染后细胞的荧光素酶活性,分析E-box元件对GCLC基因转录活性的影响。结果:成功构建出多组定点缺失E-box元件的GCLC-Luc基因。在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中转染缺失了E-box的GCLC-Luc组较转染GCLC-Luc组均有明显升高(P均<0.05)。结论:三个E-box元件(-804^-779,-729^-724,-590^-585)在GCLC基因的基础状态下的转录表达中都起到一定的抑制作用,可能以转录因子及元件复合物形式抑制GCLC基因的转录调控。此结果揭示GCLC基因上其他E-box元件之间也可能存在着相互作用方式,而非简单的单独作用。 展开更多
关键词 谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC) E-box元件 大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞(L2)
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