丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆

采用PCR方法从大肠杆菌K12染色体DNA中克隆出1.5kb的DNA片段,并将其与pUCm-T载体连接转入大肠杆菌JM109中。DNA测序分析证明该片段含有一个完整的丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)。

甲醇利用菌SDM11中glyA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

对甲醇降解菌Methylobacterium.sp SDM11中的glyA基因进行克隆及特性研究,以获得更多的丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)资源。根据GenBank中已报道的Methylobacterium extorquensAM1中的glyA基因序列(登录号:L33463)设计引物,以SDM11的基因组DNA为模板,PCR扩增glyA基因。利用pETblue-2载体将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达。PCR扩增到一个1.40 kb大小的DNA片段,经过blast软件比对分析,发现该片段与已报道的Methylobacterium extorquensAM1的glyA基因的序列相似性为95%,氨基酸序列的相似性为98%。该基因编码468个氨基酸,预测的分子量大小为52.2 kD,等电点为7.02,发现纯化后的目标蛋白具有SHMT酶活性,并初步测定了酶活力。

大肠杆菌丝氨酸羟甲基转移酶基因(glyA)的克隆和表达

利用插入失活及营养缺陷型互补法将大肠杆菌K12 13kb的glyA基因克隆到质粒pBR329中。将重组质粒酶切,亚克隆,确定2.6kb PstI-EcoRI亚克隆片段带有完整的glyA基因。共获得12株glyA基因重组菌,对重组质粒进行了酶切鉴定。不同重组菌丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)活性及其酶表达量均不相同。受体菌未检测到丝氨酸的产生。重组菌株JM109(pSM13)、K12(pSM13)、K12(pSM14)和K12(pSM15)SHMT酶表达量分别占全菌可溶性蛋白的15.7％、15.4％、11.8％和9.48％。

glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶

glyA基因广泛存在于生物体中 ,其编码的丝氨酸羟甲基转移酶 (serinehydroxymethyltransferase,SHMT)催化丝氨酸和甘氨酸之间的相互转化 ,转化反应产生的 5,1 0 亚甲基四氢叶酸 (M THF)提供细胞新陈代谢—碳单位 ,此反应在细胞新陈代谢中处于重要地位。因此 ,研究 glyA基因及其编码的丝氨酸羟甲基转移酶具有重要的意义。介绍了 glyA基因的克隆、序列分析、调控组分和丝氨酸羟甲基转移酶的部分性质。

脱脂乳中苏氨酸的浓度对嗜热链球菌乙醛产量及glyA基因表达的影响

这项研究以在酸奶发酵过程中产生良好风味Streptococcus thermophilus S13-6为实验菌株,考察了脱脂乳中苏氨酸的浓度对乙醛产量及glyA基因(编码丝氨酸羟甲基转移酶)表达的影响。结果表明,随着脱脂乳中苏氨酸浓度的增加,S13-6菌株的乙醛的产量和glyA基因的表达量明显增加。说明丝氨酸羟甲基转移酶在S13-6菌株的乙醛代谢过程中发挥着重要作用。

直接利用糖质原料产L-丝氨酸谷氨酸棒杆菌glyA基因序列分析

以能够利用糖质原料产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)SYPS-062glyA基因为研究对象,比较C.glutamicum SYPS-062与C.glutamicum模式菌株ATCC13032的glyA基因的异同。分别以SYPS-062及ATCC13032基因组为模板,利用PCR技术获得丝氨酸羟甲基转移酶编码基因glyA。核苷酸序列分析结果表明,来源于SYPS-062和ATCC13032的glyA基因片段全长均为1305bp,编码434个氨基酸,分子量为46.5kD,基因的同源性为99.54%,存在6个核苷酸的差异,引起一个氨基酸残基的突变。将获得的基因分别在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达。酶活测定结果显示,2种不同菌株来源的重组SHMT的比活力稍有差异,说明SYPS-062glyA基因的差异对其表达产物SHMT蛋白构型及功能影响不大。提示对于C.glutamicum SYPS-062能够利用糖质原料产L-丝氨酸的机制解析应进一步从glyA基因的转录水平、翻译水平及胞内SHMT辅酶的供给情况等方面进行深入研究探讨。

两种菌株来源的glyA基因的克隆、表达及酶活性检测

采用PCR方法,分别从大肠杆菌和嗜热链球菌基因组DNA中扩增获得glyA基因,分别克隆入载体pET-28 a(+)中并进行表达,分离和纯化得到两种不同来源的SHMT,分别检测两种SHMT的逆向酶活。比较来源于大肠杆菌K12与嗜热链球菌AS1.2471中的glyA基因表达的丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)的活性,以获得高活性的SHMT。结果成功获得两种菌中的glyA基因,并表达出具有较高活性的SHMT,其中嗜热链球菌中glyA基因表达出的SHMT的酶活性大约为大肠杆菌的两倍。从嗜热链球菌中克隆表达的SHMT具有更高的催化活性及良好的工业应用前景。

GlyA基因的克隆及检验

用ＰＣＲ法从大肠杆菌中调出长１．９ｋｂ的ＤＮＡ片断，插入质粒ｐＴ７７，核酸电泳和ＤＮＡ测序分析结果证明该片段是ＧｌｙＡ目的基因。

哈维氏弧菌glyA基因的克隆及原核表达分析

【目的】哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是存在于海水中的正常菌群,但近几年大密度养殖使它成为海水鱼致病甚至死亡的原因之一。对哈维氏弧菌ZJ0603株中的glyA基因进行克隆及原核表达分析,以期为下一步研制亚单位疫苗奠定基础。【方法】应用PCR技术克隆哈维氏弧菌菌株ZJ0603的glyA基因,并对其编码的丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxylmethyltransferase,SHMT)进行理化性质、信号肽、亚细胞定位及高级结构分析。将克隆获得的glyA基因与表达载体pET-28a连接构建重组质粒pET-28a-glyA,然后构建BL21-pET-28a-glyA重组菌株,测序后选取正确的菌株用IPTG诱导并对重组蛋白进行Western blot分析鉴定。对表达重组菌株BL21-pET-28a-glyA的表达条件进行优化以获得大量蛋白。【结果】生物信息学分析结果表明,glyA基因全长为1296 bp,共编码431个氨基酸,SHMT的理论等电点为6.18,不稳定系数为28.66,总平均亲水性为-0.200,整体表现为亲水且分布在细胞质中,预期蛋白分子量为46.60 ku。成功构建表达重组质粒pET-28a-glyA并转入表达菌株中,经IPTG诱导后进行Western blot分析,结果表明成功获得了SHMT重组蛋白。【结论】用控制变量法对表达条件优化后发现,IPTG最佳诱导时间、浓度以及温度分别为4 h、0.4 mmol/L和37℃。

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。

Methylocorus sp.MP 688菌株glyA基因体外表达及功能研究

Methylocorus sp.MP 688菌株具有高产吡咯喹啉醌的特性而应用于工业生产当中。分析其全基因组及代谢通路,发现在C1固定中丝氨酸循环起到重要的生理作用。为了研究丝氨酸循环中gly A基因是否具有表达丝氨酸羟甲基转移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)活性及基因缺失是否会对菌株生命活动产生影响。采用体外表达方式,纯化并检测gly A基因产物SHMT酶是否具有催化活性。通过双交换实验进行glyA基因敲除,探究gly A基因缺失是否会对菌株产生影响。结果表明,gly A基因成功在体外表达,双交换敲除实验证明glyA基因作为关键基因存在,其缺失或可致死。此外,SHMT酶在35℃,pH值7.5缓冲体系中酶促效率最高,还原剂β-巯基乙醇对SHMT酶催化活性具有促进作用。

SHMT基因工程菌的构建及高效表达

以质粒ｐＴ７７和ｐＢＲ３２２为载体，构建ＧｌｙＡ基因的重组质粒，继而得到１２株基因工程菌（ＣＷＳ系列）。其中，高表达菌株ＣＷＳ７的ＳＨＭＴ酶表达量占全菌可溶蛋白的４７％，是其宿主菌的５６倍；改善培养条件后。

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

以E.coli AB90054基因组中DNA为模板,采用PCR方法扩增得到glyA基因,将该基因克隆到表达载体pET28a(+)中,转化表达菌株BL21(DE3)后筛选阳性重组子,并对筛选所得高表达基因工程菌G16进行培养条件和表达条件的优化。结果表明,当培养条件为38℃、pH为7.0、转速为150r/min时,基因工程菌的生长速度和菌液浓度最佳;当表达条件的诱导温度为30℃、诱导剂浓度为0.5mmol/L、诱导时间为5h时,基因工程菌诱导目的蛋白表达效果最好。通过SDS-PAGE分析和酶活测定后发现,在优化条件下基因工程菌G16发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占菌体总蛋白的60%左右,且蛋白活性正常。

基于数字图象的螺旋锥齿轮齿面接触检测技术

使用数字图象处理的技术实现螺旋锥齿轮接触区的检测。对接触区的灰度和色调进行分析,根据人眼识别的特性,按照色差对齿轮接触区先进行灰度变换,再采用边缘检测算法得到较好的接触区轮廓,为齿轮的质量分析提供了参数依据。

SH2B1对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响和机制研究

目的研究同源性2b衔接蛋白1(SH2B1)对心肌细胞肥大过程中糖代谢的影响及具体机制。方法将分离培养好的乳鼠心肌细胞随机分为对照组、AngⅡ组。采用荧光定量PCR检测心肌肥大标志物ANP、BNP的mRNA表达变化,Western Blot检测SH2B1、糖代谢相关蛋白GLUT4、G6PD和信号通路AMPK的表达水平。为了进一步探索SH2B1在心肌肥厚中发挥的作用,采用小干扰RNA(siRNA)沉默SH2B1基因,将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、siSH2B1组、siSH2B1+AngⅡ组;48 h后检测上述指标的变化。然后使用AMPK抑制剂compound C处理乳鼠心肌细胞,检测AMPK对糖代谢相关蛋白的影响,将乳鼠心肌细胞分为对照组、AngⅡ组、AngⅡ+compound C组,Western Blot检测GLUT4、G6PD的蛋白表达水平。结果与对照组相比,AngⅡ组SH2B1、GLUT4、G6PD蛋白表达水平上调,差异有统计学意义(P<0.05),AMPK表达差异无统计学意义(P>0.05),而磷酸化AMPK表达增强,差异具有统计学意义(P<0.05)。与siNeg组相比,siSH2B1组SH2B1表达量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05);与siNeg+AngⅡ组相比,siSH2BI+AngⅡ组GLUT4、G6PD蛋白表达减少,AMPK的磷酸化水平减弱,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论SH2B1可通过促进心肌细胞糖代谢而加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大,其机制可能与AMPK信号通路相关。