广适高产高蛋白大豆品种中黄13的选育与应用

中黄13是中国农业科学院作物科学研究所大豆高产优质育种团队历经20多年育成的广适高产高蛋白大豆品种。该品种以豫豆8号为母本,中90052-76为父本,经有性杂交利用系谱法选育而成,原品系号为中作975。该品种主要技术特点:一是适应性广。先后通过国家以及安徽、河南、湖北、陕西、山西、北京、天津、辽宁、四川9个省市审定,适宜种植区域N29°～42°,跨3个生态区13个纬度,是迄今国内纬度跨度最大、适应范围最广的大豆品种。中黄13光周期钝感,蓝光受体基因(Gm CRY1a)研究结果揭示了其适应性广的分子机理。二是高产。在山西省襄垣县创4 686 kg·hm-2的大豆高产记录,在推广面积最大的安徽省区试平均产量3 041 kg·hm-2,增产16. 0%,全部25个试点均增产,产量列参试品种首位。三是优质。蛋白质含量高达45. 8%,百粒重24～26 g,商品品质好。四是多抗。抗倒伏,耐涝,抗花叶病毒病,中抗胞囊线虫病。采用良种良法相结合实现了中黄13大面积推广应用,自2007年以来已连续9年位居全国大豆年种植面积首位;截止2018年,累计推广面积超1亿亩。2009年获国家自主创新产品证书,2010年获第十二届中国国际高新技术交易会优秀产品奖,2010年获北京市科学技术一等奖,2012年获国家科技进步一等奖。2006年授权中国植物新品种权,2008年授权韩国植物新品种权。

气象因子对大豆主要贮藏蛋白组分及亚基含量的影响

以20个大豆品种为材料,同年同地点分6个播期种植,考察了整个生长期以及营养生长和生殖生长两个时期的气象因子(总积温、总日照时数、总降水量、日均温差和日均相对湿度),对春大豆和夏大豆籽粒总蛋白以及主要贮藏蛋白组分、亚基相对百分含量的影响。结果表明:(1)大豆籽粒总蛋白含量以及组分、亚基相对百分含量会随播期的改变而变化。(2)整个生育期间,5个气象因子极显著影响20份大豆总蛋白含量,对春大豆总蛋白含量的影响也达极显著水平,仅总积温、总日照时数和总降水量对夏大豆总蛋白含量影响达显著水平。(3)整个生育期的总积温和总日照时数与20份大豆蛋白11S相对百分含量和11S/7S比值显著负相关,总积温与20份大豆蛋白7S含量显著正相关;但气象因子对春、夏大豆的7S、11S相对百分含量和11S/7S比值的影响不显著。(4)整个生育期间气象因子对各组分亚基的影响程度存在差异;夏大豆各蛋白组分亚基的相对百分含量受两个生育时期的气象因子影响皆不显著,而春大豆许多蛋白亚基相对百分含量受两个生育时期的气象因子的影响达到显著或极显著水平。

高效液相色谱法(HPLC)测定大豆异黄酮含量的研究

建立检测大豆异黄酮5种组分（染料木素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷和黄豆黄苷）含量的高效液相色谱法,并且测定了大豆各组织和不同时期胚的异黄酮含量。色谱条件：Phenomenex C18色谱柱（150 mm×4.6 mm,5.0μm）;流动相：甲醇-水（30∶70,v/v）;流速：1 mL.min-1,检测波长：254 nm;柱温：40℃,进样量：10μL。试验建立的色谱条件能使大豆异黄酮主要组分得到很好分离,线性关系R2为0.9994~0.9998,回收率为99.29%~100.76%且变异系数小于3%,适用于大豆异黄酮不同组分的检测。不同大豆品种异黄酮含量表现为：吉林32〉GR8836〉吉大豆2号〉平安8〉小黑豆〉吉林47〉吉林35〉吉大豆1号;吉林32各组分大豆异黄酮含量表现为：大豆籽粒〉60 d胚〉50 d胚〉40 d胚〉花〉荚〉20 d胚〉30 d胚〉叶〉根〉茎。

获得转反义PEP基因超高油大豆新材料

利用基因工程技术进行植物高油育种,是当前国际上植物基因工程研究的热点之一。大豆是世界上植物油和植物蛋白质最重要的来源,随着人们生活水平的不断提高和养殖业的迅速发展,我国高油大豆需求量急剧增加。在不增加大豆面积的前提下,提高单位面积含油量的重要手段之一就是培育栽培高油大豆品种。由此,从2000年作者利用农杆菌介导法将反义PEP基因导入大豆的基因组,相继获得了转基因大豆植株,经多代连续筛选、鉴定,获得了稳定的超高油(脂肪25%)大豆品系。本研究首次报道利用基因工程手段大幅度提高大豆含油量。

大豆7S球蛋白α'亚基缺失及(α'+α)亚基双缺失品系的回交转育

7S球蛋白α'与α亚基是大豆种子贮藏蛋白的重要组分,是影响大豆营养价值与加工品质的重要因子,同时还是主要的大豆致敏原,降低它们的含量是大豆品质改良育种的最新研究热点之一。以日本育种材料7S球蛋白(α'+α)-亚基双缺失型日B为供体亲本,黑龙江省主栽大豆品种东农47为受体亲本,采用回交转育方法,将α'与(α'+α)-亚基缺失特性导入东农47。结果表明,α'-缺失型(Cc)和(α'+α)-双缺失型(Cd)品系均能正常生长、结实,并能稳定遗传;Cc、Cd产量组分性状的平均值均远高于轮回亲本,蛋白质含量平均值均高于双亲,部分Cd株系籽粒蛋白质总量高达46.7%,脂肪含量平均值介于双亲之间,略高于日B;导入α'-缺失和(α'+α)双缺失性状后,绝大多数氨基酸组分含量和氨基酸总量提高,其中精氨酸和天门冬氨酸平均含量变幅最大。Cd株系籽粒含硫氨基酸含量(蛋氨酸与胱氨酸之和)及氨基酸总量分别比东农47高出0.11和5.56个百分点。说明通过常规育种重组α'-缺失或(α'+α)-双缺失性状即可提高大豆含硫氨基酸含量,并提高其他氨基酸组分含量及氨基酸总量,在Cc、Cd的BC2F3后代群体中有望筛选到α'-缺失或α'与α同时缺失的高产、高含硫氨基酸、优质大豆新品种。

中国野生和栽培大豆蛋白质及油脂含量的比较分析

蛋白质和油脂是大豆的主要营养成分,掌握大豆种质蛋白质和油脂含量的遗传变异是专用型品种选育的基础。以全国各生态区的野生豆138份、地方品种408份、国内育成品种145份、国外育成品种77份,合计768份大豆种质为材料,测定蛋白质和油脂含量,研究其遗传变异特点。结果表明:在南京同一环境下全国野生豆蛋白质含量、油脂含量和蛋脂总含量变幅分别为39.2%～54.2%、7.5%～17.5%和47.3%～64.6%,地方品种38.8%～51.5%、11.5%～22.5%和55.6%～69.0%,国内育成品种41.7%～49.4%、12.9%～22.9%和55.6%～68.6%。野生豆驯化为栽培豆并经人工选育后油脂含量和蛋脂总含量有大幅增加,而蛋白质含量平均数和变异度则有减小,说明以往人工进化着重在油脂含量的改进。三个性状各群体在各生态区内均有较大变异,区平均间差异并不大,各区都有优良变异。野生豆蛋白质含量、油脂含量和蛋脂总含量与来源地纬度并未发现相关;栽培豆地方品种和育成品种的油脂含量与地理纬度出现显著正相关;育成品种蛋白质含量与地理纬度还出现显著负相关;野生自然状态下蛋白质含量和油脂含量之间无相关,而栽培豆地方品种和育成品种依次增强了负相关;形成这种相关的原因在于地区间油脂含量人工进化程度的差异。

大豆锌指转录因子GmDi19-5对高温的响应及互作蛋白的筛选

【目的】高温胁迫已经成为威胁作物生长发育的主要非生物胁迫因素之一,转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用。通过对大豆锌指转录因子基因Gm Di19-5在高温胁迫下的响应和功能鉴定,以及利用酵母双杂交技术从大豆c DNA文库筛选与其互作的候选蛋白,研究Gm Di19-5对高温胁迫的响应机制。【方法】以大豆c DNA为模板,利用实时荧光定量PCR检测Gm Di19-5在高温处理不同时间段的表达模式;通过Plant CARE和PLACE数据库预测Gm Di19-5启动子元件,并对Gm Di19-5启动子转基因拟南芥在高温处理下进行的组织化学染色,分析Gm Di19-5启动子在高温胁迫下的活性;构建p GBKT7-Gm Di19-5诱饵载体,验证自激活活性;利用酵母双杂交技术,以p GBKT7-Gm Di19-5为诱饵筛选大豆c DNA文库,筛选与其互作的候选蛋白;进一步用酵母双杂交系统验证Gm Di19-5与候选蛋白的互作;利用实时荧光定量PCR检测候选蛋白基因在对高温处理的响应情况;构建融合表达载体,用GFP-Gm Di19-5融合表达载体转化拟南芥原生质体,检测Gm Di19-5蛋白的亚细胞定位情况。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,Gm Di19-5在高温胁迫下上调表达;启动子元件分析表明,Gm Di19-5包含多种与胁迫应答相关的顺式作用元件,包括热响应元件HSE;组织化学染色分析发现,经高温处理后,过表达拟南芥幼苗的地上部分和地下部分均有报告基因的表达;亚细胞定位结果表明,Gm Di19-5蛋白定位于拟南芥原生质体的细胞核中;通过酵母双杂交技术筛选到了与Gm Di19-5互作的候选蛋白,试验进一步验证了Gm Di19-5与Gm Dna J在酵母细胞中互作;另外,实时荧光定量PCR结果显示,互作蛋白基因Gm Dna J受高温胁迫诱导表达。【结论】Gm Di19-5受高温诱导表达,Gm Di19-5可能与Gm Dna J互作,表明Gm Di19-5功能的发挥可能需要Gm Dna J的参与。

利用选择回交导入群体定位大豆蛋白质含量QTL

大豆是重要的植物蛋白来源,定位大豆蛋白质含量QTL,可为分子标记辅助育种和基因挖掘提供依据。本研究以我国综合性状优良的黄淮海主栽品种中黄13为轮回亲本,日本品种东山69为供体亲本,构建了BC2F2回交导入系群体;利用性状–标记间的单向方差分析和卡方测验检测BC2F2随机群体(RP)及选择回交导入群体(BSP、PSP和NSP)中影响大豆蛋白质含量的QTL。2种方法在4个群体中定位到蛋白质含量相关的QTL 42个,5个位点在随机群体和极端选择群体中被多次重复检测到,分别为Sat_202、Satt170、Satt282、Sat_074、和Satt146;单向方差分析在随机群体和双向选择群体中同时检测到Sat_077、Sat_202、Satt282、Satt146和Satt712等5个效应值较大(>10%)的蛋白质含量QTL,分别位于C1、C2、D1b、F和J连锁群上,位于D1b和J连锁群上的Satt282和Satt712效应最大,F值达到8.77、7.80和9.01、11.61,与其连锁的QTL能解释的表型变异分别达13.55%、21.40%和13.85%、28.82%;卡方测验在极端选择群体中检测到的8个QTL与单向方差分析在随机群体中检测到的位点一致,其中双向选择群体检测到4个(Sat_202、Satt301、Sat_074和Satt146)、正向选择群体检测到2个(Satt250和Satt485)、负向选择群体检测到5个(Sat_202、Satt170、Satt282、Sat_074和Satt146)。定位到42个蛋白质相关QTL,结果表明单向方差分析对双向选择群体有一定的应用价值,卡方测验更适合单向选择群体的QTL检测。

大豆油分蛋白质含量相关QTL的实用性验证

本文利用己发表的一些与油分、蛋白质含量主效QTL相连锁的SSR标记，对72份全国各地高油、高蛋白种质资源进行蛋白质和油分含量的分析。通过对9个SSR位点各等位变异的蛋白质和油份含量的方差分析，检测到4个与油分含量相关的等位变异，以及4个与蛋白质含量相关的等位变异。其中satt193、satt491、satt030和satt331分别在DNA片段长度为210～280bp之间检测出与油分含量相关的等位变异。Satt523、satt321、satt231和satt578在DNA片段长度为170-320bp之间检测出和蛋白质含量相关的等位变异。实验证实了与这些位点相连锁OTL的通用性及实用性。

大豆巢式关联作图群体蛋白质含量的遗传解析

【目的】大豆是重要的经济作物,是人类植物蛋白质和油脂的主要来源。蛋白质含量作为大豆育种的主要目标之一,属于多基因控制的复杂数量性状,并且受环境条件的影响。通过对大豆巢式关联作图群体的蛋白质含量进行全基因组关联分析,解析其遗传构成,为高蛋白质含量的大豆品种育种提供理论基础。【方法】以蒙8206为共同亲本,对临河×蒙8206、正阳×蒙8206、蒙8206×通山与蒙8206×WSB分别杂交,通过单粒传法自交7代衍生的4个重组自交系群体,共计623个家系,整合为一个大豆巢式关联作图群体,利用RAD-seq技术进行SNP标记基因分型,并于2012年至2014年将该群体种植在5个不同田间环境,在大豆完熟期R8时测定蛋白质含量,利用限制性两阶段多位点全基因组关联分析方法(RTM-GWAS)来解析蛋白质含量的遗传构成。【结果】试验群体的蛋白质含量变异较大,蛋白质含量性状遗传率较高,遗传变异可解释85.00%的表型变异。多环境联合方差分析表明,蛋白质含量的基因型、环境以及基因型×环境均达到差异极显著水平。全基因组关联分析共检测到90个蛋白质含量QTL,其中新检测到20个QTL,每个QTL的表型变异解释率为0.06%—3.99%,贡献率总和为45.60%。每个QTL包含2—5个等位变异,等位变异效应为-2.434%—2.845%,大多数等位变异效应为-1.000%-1.000%,表明大多数等位变异的效应较小。根据检测的90个蛋白质含量QTL,预测了73个蛋白质含量相关基因,其中Glyma20g24830参与甘氨酸与芳香族氨基酸代谢,Glyma18g03540参与半胱氨酸生物合成,推测其为重要蛋白质含量候选基因。根据试验群体的蛋白质含量QTL-allele矩阵,预测出潜在杂交组合的纯系后代的蛋白质含量育种潜力高达56.5%。【结论】检测到90个大豆蛋白质含量QTL,新检测到20个QTL,预测到73个蛋白质含量相关基因,表明大豆蛋白质含量是由多基因控制的数量性状。

大豆GmNAC73-like基因的克隆和表达及其对GmIFS2基因的影响

为研究NAC转录因子对大豆〔Glycine max(Linn.)Merr.〕异黄酮合成的影响,根据大豆基因组序列设计引物,从豆荚中克隆获得Gm NAC73-like基因,并对该基因序列进行生物信息学分析。结果显示:Gm NAC73-like基因包含1个长度981 bp的完整开放阅读框,编码326个氨基酸。Gm NAC73-like蛋白的理论相对分子质量37 000,理论等电点p I 6.4,为亲水性蛋白,无信号肽,并被定位在细胞核上,包含核定位信号"PKRRK"。同源性比对结果显示:Gm NAC73-like蛋白与野大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)、可可(Theobroma cacao Linn.)、葡萄(Vitis vinifera Linn.)及拟南芥〔Arabidopsis thaliana(Linn.)Heynh.〕的NAC蛋白具有较高的相似性,相似度分别为93%、69%、73%、75%和58%。在NJ系统树上,Gm NAC73-like蛋白与野大豆的Gs NAC8蛋白和木豆〔Cajanus cajan(Linn.)Millsp.〕的Cc NAC8蛋白聚在一起,显示出较近的亲缘关系。半定量RT-PCR分析结果显示:在大豆的三叶期、开花期和结荚期,Gm NAC73-like基因在根中均不表达,在茎和叶中可不同程度表达且茎中表达量较高;而在开花期或结荚期,该基因在花或豆荚中也可表达,且豆荚中表达量较高。酵母单杂交实验结果显示:Gm NAC73-like可与异黄酮生物合成关键酶基因Gm IFS2启动子中的CGTG基序结合;在大豆转基因发状根系中过表达Gm NAC73-like基因后,除查尔酮异构酶基因的表达量无变化外,其他异黄酮生物合成相关基因的表达量均不同程度提高,其中,肉桂酸-4-羟化酶基因和查尔酮合酶基因的表达量明显提高。此外,在Gm NAC73-like基因过表达的大豆转基因发状根系中总异黄酮含量显著降低。综合分析结果表明:Gm NAC73-like可能通过与MYB转录因子的互作调控Gm IFS2基因的表达,并在大豆异黄酮的生物合成过程中起负调控作用。

3种蛋白含量大豆生育期内不同部位GS基因家族成员表达量差异及GS活性分析

【目的】研究谷氨酰胺合成酶（GS）各基因家族成员在不同蛋白含量大豆生育期间的表达量，认识高蛋白大豆籽粒蛋白质形成的特点．【方法】选择普通栽培大豆、高蛋白栽培大豆和高蛋白野生大豆为材料，研究了整个生育期间邯基因家族各成员在根、茎、叶和根瘤的表达量差异以及不同类型大豆根、茎和叶谷氨酰胺合成酶活性（GSA）的变化．【结果和结论】结果表明：不同蛋白含量大豆各器官中嬲基因家族不同成员的表达量具有明显的差异．GSβI在根、茎、叶和根瘤中都能高效表达；叶中GS2表达量显著升高，超过其他器官和根瘤．GSβl在根、茎、叶中表达量极低，而根瘤GSβl的表达量明显增加．生育期内各器官GSβI及V3～R3期GS总表达量、叶GS2、根瘤GSβl都表现为高蛋白类型大豆高于普通栽培大豆，这与不同蛋白含量大豆GSA的变化规律基本一致．在生育期间高蛋白类型大豆较普通栽培大豆能更有效地调控邯基因家族各成员的表达，获得GSA是籽粒蛋白质含量较高的生理特点之一．

高压交变芒刺电场对大豆种子萌发及活力的影响

将水域中培养的大豆种子,置于电场中处理3 d,30 min/d,25℃光照培养箱中培养,使其发芽.观察测量其发芽势、发芽率、发芽指数、活力指数、芽长、芽鲜质量、芽干质量和过氧化氢酶活性(POD activity)及可溶性蛋白含量(soluble protein content)等指标.结果发现,高压交变芒刺电场对大豆种子萌芽具有促进作用,特别是2 kV电场处理组与对照组相比发芽率、发芽指数和活力指数分别提高了15.0%,51.2%和127.4%,过氧化氢酶活性比对照组提高83.9%,可溶性蛋白含量比对照组提高16.1%.

高蛋白野生大豆叶片氮代谢物及根瘤GSγ1和Glba表达分析

为明确高蛋白野生大豆籽粒高蛋白形成过程中特有的遗传规律,以高蛋白栽培大豆为对照,对两类材料整个生育期叶片氮同化物相关指标,及根瘤谷氨酰胺合成酶基因(GSγ1)和豆血红蛋白基因(Glba)表达量的差异进行研究。结果表明:两类型大豆间存在明显差异。R3之后,栽培大豆比野生大豆叶片可溶性蛋白含量下降趋势明显。野生大豆叶片GSA在R3之前增长明显,R3之后下降缓慢。整个生育期间野生大豆叶片硝酸还原酶活性都要高于栽培大豆。野生大豆根瘤中GSγ1表达量在R3之前明显高于栽培大豆,R3期之后相反。从V6开始直到成熟,栽培大豆根瘤Glba的表达量都要高于野生大豆。说明野生大豆生育前期氮代谢及各种物质的合成、代谢较旺盛,而且能长时间地保持叶片高的可溶性蛋白含量及硝酸还原酶活性是籽粒高蛋白形成的原因之一。