胀果甘草粗多糖及其纯化多糖对树突状细胞成熟和抗肿瘤作用的影响及机制

目的研究胀果甘草粗多糖(GiP)及其纯化多糖GiP-B1对荷瘤小鼠树突状细胞(DC)成熟和抗肿瘤作用的影响及机制。方法将体外培养的肝癌细胞H22荷瘤小鼠未成熟DC(imDC)分为对照组、肿瘤坏死因子α(TNF-α)组、GiP组及GiP-B1组,检测荷瘤小鼠成熟DC(mDC)的细胞活力,表面标志物(CD11c、CD80、CD86、MHC-Ⅱ)阳性表达率,白细胞介素12p70(IL-12p70)及IL-4水平;通过荷瘤小鼠m DC与CD4^(+)T淋巴细胞共培养生成CD4-细胞毒性T细胞(CD4-CTL),检测刺激指数,CD4-CTL上清液中IL-12p70、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-4、IL-10水平及对H22细胞的杀伤活性;检测共培养后荷瘤小鼠mDC中IL-12、IL-12受体(IL-12R)、信号转导和转录激活因子4(STAT-4)mRNA表达量,以及IL-12Rβ2蛋白表达量,核转录因子κB(NF-κB)p65、STAT-4蛋白磷酸化水平。结果与对照组比较,GiP组与GiP-B1组荷瘤小鼠mDC细胞活力、MHC-Ⅱ阳性表达率以及IL-12p70、IL-4水平均显著升高(P<0.05),CD11c、CD80、CD86阳性表达率均有升高趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。共培养后刺激指数、IL-12p70、IFN-γ水平均显著升高(P<0.05),IL-4、IL-10(GiP组除外)水平均显著降低(P<0.05),对H22细胞的杀伤活性均显著增强(P<0.05);荷瘤小鼠m DC中IL-12、IL-12R(GiP组除外)、STAT-4 mRNA表达量,IL-12Rβ2蛋白表达量以及NF-κB p65、STAT-4蛋白磷酸化水平均显著升高(P<0.05)。结论GiP及GiP-B1对荷瘤小鼠DC的成熟有较好的促进作用,能有效刺激CD4^(+)T细胞增殖并增强CD4-CTL的抗肿瘤活性,其作用机制可能与激活IL-12/NF-κB/STAT-4信号通路有关。

甘草多糖对LPS诱导的A549细胞炎症损伤的拮抗作用研究

甘草是世界上应用最广泛草本植物之一,其中主要提取物甘草多糖是具有多种生物活性的多糖类化合物.旨在探究甘草多糖(Glycyrrhiza polysaccharide)对脂多糖(LPS)诱导的A549细胞炎症的拮抗作用的分子机理,为治疗肺部炎症疾病提供一定理论依据.采用水提醇沉法提取甘草多糖粗提物.利用细胞增殖检测试剂盒CCK-8检测不同浓度甘草多糖以及LPS对A549细胞活力的影响;利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞内TNF-α和IL-6因子的表达情况;利用实时荧光定量PCR检测细胞内IL-6、IL-1β、NF-κB的mRNA水平的表达情况.与对照组相比,甘草多糖能够促进A549细胞活力升高,而LPS处理A549细胞后细胞活力显著下降.ELISA法检测结果表示,相比对照组,LPS处理后细胞炎症因子TNF-α和IL-6的含量显著升高,LPS和甘草多糖复合处理后A549细胞内的TNF-α和IL-6因子显著降低.进一步实时荧光定量PCR结果表明,LPS组中细胞IL-6、IL-1β和NF-κB炎症因子mRNA的表达明显升高,甘草多糖处理后细胞中IL-6、IL-1β和NF-κB炎症因子mRNA的表达显著降低.与LPS组相比,甘草多糖能够显著降低炎症因子mRNA的表达.综上所述,甘草多糖对LPS诱导的A549细胞炎症损伤起拮抗作用,其可能机理是通过抑制NF-κB信号通路.

稀土元素对甘草细胞生长及甘草酸合成的影响

以胀果甘草根愈伤组织为材料,研究了在150mL摇瓶中,不同浓度的两种稀土离子镧、亚铈对甘草细胞生长及甘草酸分泌和释放的影响。结果表明,在悬浮培养初期、指数期加入稀土元素,改变了细胞生长状况,均使细胞在整体上生物量减少;不同种类的稀土离子、不同的稀土浓度对细胞生长影响强弱不同,但趋势相似。其中,培养指数期,加入500μL镧溶液的培养液中,所得甘草细胞生物量较多,利用薄层-紫外分光光度计法检测到甘草酸含量为67.68mg/g。

不同诱导子对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响

目的研究水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高盐、超声等诱导子对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响。方法向细胞悬浮液中加入各种诱导子或对细胞悬浮液进行超声处理。结果加入10 mg·L-1水杨酸可使甘草酸的含量为对照组的1.86倍。低浓度的酵母提取物对甘草酸的积累有显著的促进作用,加入1 mg·L-1酵母提取物时,甘草酸的含量为对照组的3.71倍,达到14.20μg·g-1。添加100 mg·L-1水解酪蛋白时,甘草酸的含量为对照组的1.69倍。高盐胁迫对甘草酸的积累有较高的影响,其含量为对照组的1.96倍。结论甘草细胞悬浮培养中,添加水杨酸、酵母提取物、水解酪蛋白、高糖、高盐、超声等诱导子是提高细胞中甘草酸含量的有效方法之一。

胀果甘草细胞的悬浮培养

切取胀果甘草(Glycyrrhiza inflate)无菌苗的子叶、下胚轴和根段外植体进行愈伤组织的诱导和悬浮细胞培养,建立了胀果甘草细胞悬浮培养体系,测定了悬浮培养细胞的生长曲线,并且研究了接种量、条件培养和激素组合对胀果甘草悬浮细胞生长的影响.结果表明子叶来源的愈伤组织最适合作为胀果甘草细胞悬浮培养的起始培养物;悬浮培养的最佳接种量为35 g/L;条件培养基的最佳用量为总培养体积的1/3;最适合胀果甘草悬浮细胞生长的培养基是附加了NAA 1.0 mg/L+KT 0.5 mg/L激素组合的MS培养基.

不同附加物对甘草悬浮培养细胞中甘草酸积累的影响

目的:研究醋酸钠、苯丙氨酸、亮氨酸对甘草细胞悬浮培养中甘草酸积累的影响。方法:在培养的第0天,向培养基中加入各种附加物,甘草酸的含量分析采用高效液相色谱法。结果:较低浓度的醋酸钠(0.1 mmol.L-1)可以较明显的促进甘草细胞中甘草酸的积累,其含量为对照组的2.40倍。当苯丙氨酸添加浓度由0.1 mmol.L-1增加到2 mmol.L-1时,细胞中甘草酸的含量逐渐提高。2 mmol.L-1的苯丙氨酸使甘草酸的含量达到14.10μg.g-1,为对照组的3.60倍。添加0.1 mmol.L-1亮氨酸使甘草酸的含量提高了2.24倍。随着亮氨酸添加浓度的增加,甘草细胞中甘草酸的含量逐渐降低,添加2 mmol.L-1亮氨酸对甘草酸积累有明显的抑制作用。结论:甘草细胞悬浮培养中,适量的添加醋酸钠、苯丙氨酸及亮氨酸等附加物是提高细胞中甘草酸含量的有效方式之一。

甘草多糖对小鼠细胞免疫的影响

目的:观察甘草的有效成分甘草多糖(Glycyrrhiza Polysaccharide)对细胞免疫的调节作用;方法:给胃灌甘草多糖14d,测定二硝基氟苯诱导的小鼠迟发性超敏反应(DTH),用放射免疫法检测血中IL-2、TNF-α含量,观察甘草多糖对小鼠细胞免疫功能的影响;结果:与空白组比较,甘草多糖对DTH反应有一定的增强作用,能升高血中IL-2、TNF-α含量;结论:甘草多糖能明显增强小鼠细胞免疫功能。

甘草提取物诱导胃癌MGC-803细胞凋亡的初步研究

目的 :研究甘草提取物诱导胃癌MGC 80 3细胞发生凋亡。方法 :用荧光双染、琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪等方法 ,观察甘草提取物处理MGC 80 3细胞后细胞形态和染色质DNA等的变化 ,以双重免疫标记法和免疫组化法检测处理前后 p53基因表达的变化。结果 :激光扫描共聚焦显微镜观察到处于不同凋亡进程中的细胞 ;流式细胞仪检测到显著的凋亡峰 ,且凋亡百分率呈浓度、时间依赖性 ;高浓度甘草提取物处理的MGC 80 3细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳呈现典型的“ladder” ;甘草提取物对p53基因表达没有影响。结论 :甘草通过p53非依赖途径诱导MGC 80 3细胞凋亡 ,可望作为一种新的细胞凋亡诱导剂用于胃癌的治疗。

甘草细胞培养物中Echinatin的分离与鉴定

从甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的幼苗诱导出愈伤组织,经细胞悬浮培养及5L和25L内循环气升式反应器扩大培养,所得甘草细胞中未检出其主要成分甘草酸,但从中分离到一种黄色结晶,鉴定为4,4′-二羟基-2-甲氧基查尔酮(echinatin)。分析了甘草培养细胞不能合成甘草酸的原因,并探讨了echinatin的生物合成途径。

甘草悬浮细胞培养生产甘草总黄酮的研究

探讨了胀果甘草和光果甘草愈伤组织诱导培养的条件,并建立了甘草的悬浮细胞系,同时还分析了甘草细胞中总黄酮的含量。结果表明,用浓硫酸处理40 min后,甘草种子的萌发率最高。在甘草愈伤组织诱导形成时,采用MS+2,4-D(1.0 mg·L-1)+6-BA(1.0 mg·L-1)+NAA(1.0 mg·L-1)培养基并以下胚轴为外植体的诱导率最高,达到90%,而且在继代培养基MS+NAA(0.5 mg·L-1)+2,4-D(0.5 mg·L-1)+6-BA(0.5 mg·L-1)中愈伤组织生长速度较快、状态最好。此外,在建立的甘草悬浮细胞系中,胀果甘草细胞株B12、B4和光果甘草细胞株G2的甘草总黄酮含量分别为干重的1.8%、1.2%和0.66%。

甘草黄酮对S_(180)和H_(22)荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA和RNA的影响

目的观察甘草黄酮对S180和H22荷瘤小鼠肿瘤细胞DNA及RNA的影响。方法S180和H22荷瘤小鼠随机分为甘草黄酮高、中、低剂量(25、11.25、5.58 m g/kg)组,阳性对照(环磷酰胺25 m g/kg)组和阴性对照(生理盐水)组,各组均sc给药。运用激光扫描共聚焦显微镜技术与吖啶橙(AO)荧光探针技术结合检测单一肿瘤细胞DNA和RNA的变化情况。结果不同剂量甘草黄酮组和环磷酰胺组的DNA及RNA荧光强度较生理盐水组有不同程度的减弱;甘草黄酮高、低剂量组RNA/DAN值与生理盐水组比较差异无显著性;甘草黄酮中剂量组、环磷酰胺组RNA/DNA值较生理盐水组有非常显著提高(P<0.01)。结论甘草黄酮与肿瘤细胞DNA和RNA结合后抑制其进一步复制与合成,可能是其抗肿瘤作用的途径之一。

甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移及多胺含量影响的研究

目的:观察甘草糖提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移及细胞内多胺(腐胺、精脒和精胺)含量的影响。方法:划痕法造细胞损伤后迁移模型,柱前衍生-高效液相色谱法测定细胞内多胺含量。观察甘草糖复合物对细胞迁移及细胞内多胺含量的影响;观察甘草糖复合物对二氟甲基鸟氨酸(DFMO)致细胞迁移抑制和多胺合成抑制的影响。结果:甘草糖提取物(50、100 mg/L)能促进细胞迁移;可逆转由DFMO所致的细胞迁移抑制;可提高细胞迁移过程中细胞内多胺含量;可逆转由DFMO所致的多胺含量降低。结论:甘草对胃肠黏膜损伤的修复作用可能与其提高细胞多胺含量、促进细胞迁移有关。

胀果甘草悬浮细胞中黄酮类化合物HPLC分析

用HPLC法建立野生胀果甘草与悬浮培养的胀果甘草细胞中黄酮类化合物的HPLC指纹图谱,并采用LC-MS技术推测HPLC共有峰中主要指纹峰的化学结构。采用Agilent EclipseXDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为乙腈:0.1%冰醋酸,梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长310 nm。Agilent1100LC/MSD液质联用系统,ESI源。在设定的色谱条件下,分别得到的野生甘草与甘草细胞中黄酮类化合物指纹图谱,用中国药典相似度评价系统软件进行评价相似度为75.2%,根据LC-MS结果推断了HPLC共有峰中2个主要指纹峰分别为甘草苷和甘草素。结果表明野生甘草中绝大部分黄酮类化合物在甘草细胞中均有合成,使利用细胞悬浮培养生产的甘草黄酮类化合物成为可行的途径。

党参、甘草糖提取物对小肠上皮细胞迁移多胺信号通路的影响

目的观察益气健脾中药党参、甘草的糖提取物对小肠上皮细胞(IEC-6)迁移过程多胺介导钾通道激活信号通路的影响,探讨党参、甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法在IEC-6细胞迁移模型上,于正常或抑制多胺(加入DFMO)时,观察党参、甘草糖提取物对该信号通路的作用:(1)Western blot检测钾通道蛋白Kv1.1蛋白表达;(2)流式细胞仪检测细胞膜电位;(3)激光共聚焦显微镜检测细胞内Ca^(2+)水平;(4)Western blot检测Ca^(2+)下游指标RhoA蛋白表达。结果党参、甘草糖提取物在细胞迁移过程可以:(1)提高Kv1.1蛋白表达水平,改善DFMO所致Kv1.1蛋白表达下降;(2)提高细胞膜电位超极化水平,逆转DFMO所致细胞膜电位去极化;(3)提高细胞内Ca^(2+)水平,党参糖提取物可逆转DFMO所致Ca^(2+)水平降低;(4)提高RhoA蛋白表达水平,改善DFMO所致RhoA蛋白表达降低。结论党参、甘草糖提取物促进IEC-6细胞迁移的作用机制与其影响多胺介导钾通道激活信号通路有关。

党参和甘草糖复合物对IEC-6细胞迁移和膜电位的影响

目的观察党参糖复合物和甘草糖复合物对小肠上皮细胞IEC-6迁移和细胞膜电位的影响,探讨益气健脾中药党参和甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制。方法在正常或钾通道抑制剂4-氨基吡啶(4-AP)负荷下,分别加入党参和甘草糖复合物(25~200 mg·L^(-1))与IEC-6细胞培养24 h,相差显微镜下观察细胞迁移数,流式细胞仪检测细胞膜电位。结果与细胞正常对照组比较,党参和甘草糖复合物(50和100 mg·L^(-1))可提高细胞迁移数(P<0.01,P<0.05)。与正常对照组比较,4-AP可减少细胞迁移数(P<0.01);与4-AP模型组比较,党参和甘草糖复合物(50~200 mg·L^(-1))可逆转4-AP所致的细胞迁移抑制(P<0.01)。流式细胞仪检测结果表明,与正常对照组比较,党参和甘草糖复合物(50 mg·L^(-1))可提高细胞膜电位(P<0.01),增加细胞膜超极化水平;与正常对照组比较,4-AP模型组细胞膜电位降低(P<0.01),增加细胞膜去极化水平;与4-AP模型组比较,党参和甘草糖复合物(100和200 mg·L^(-1))可逆转4-AP所致的细胞膜去极化(P<0.01)。结论党参和甘草促进胃肠黏膜损伤修复的作用机制,可能与其糖复合物影响小肠上皮细胞迁移的多胺介导钾通道激活信号通路有关。

甘草不同时期愈伤组织细胞形态与线粒体变化的研究

此试验为甘草愈伤组织继代培养和进一步研究提供方法依据。以乌拉尔甘草不同来源愈伤组织为材料,采用石蜡切片法观察了不同时期甘草愈伤组织细胞大小变化;采用悬滴法观察了不同时期甘草愈伤组织线粒体形态、大小变化。试验结果表明:愈伤组织细胞大小受外植体来源影响显著(P<0.05),芽来源愈伤组织细胞大小(均值31.40μm)大于叶来源愈伤组织细胞大小(均值29.41μm),且大于根来源愈伤组织细胞大小(均值25.67μm);愈伤组织细胞大小受培养时期影响极显著(P<0.01),培养到30天时细胞达最大,均值为37.45μm,之后到40天时,细胞平均减小到29.55μm。芽和叶来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目高于根来源愈伤组织细胞内的哑铃状线粒体数目。愈伤组织细胞线粒体大小与外植体来源及培养时期有显著交互作用(P<0.05),根来源愈伤组织在培养30天时线粒体长度均值最大,达2.60μm。芽来源愈伤组织在培养40天时线粒体长度均值最大,达2.07μm。叶来源愈伤组织在细胞培养40天时线粒体长度均值最大,达2.01μm;培养时期对愈伤组织细胞线粒体大小影响极显著(P<0.01),培养到30天时细胞最大,均值为2.06μm。此研究结果为甘草愈伤组织继代培养奠定了基础,同时为甘草脱分化及再分化调控提供细胞学方面的依据。

四种前体对胀果甘草细胞悬浮培养生产甘草黄酮的调控效果评价

在胀果甘草细胞悬浮体系中加入苯丙氨酸、酪氨酸、肉桂酸和乙酸钠来研究前体对甘草细胞生产甘草黄酮的影响。结果显示,4种前体在合适的浓度下对细胞的生长没有明显的抑制作用,而且均能促进细胞内甘草黄酮的生物合成,但高浓度的肉桂酸对细胞的生长有一定的抑制作用。苯丙氨酸的最佳添加浓度为20 mg/L,酪氨酸、肉桂酸、乙酸钠的最佳添加浓度都是5 mg/L。此时,均可使培养体系的甘草黄酮产量高达100 mg/L以上,其中酪氨酸的添加使得产量高达对照的1.43倍。苯丙氨酸、肉桂酸和乙酸钠3种前体的添加时间均以第10天为宜,酪氨酸添加时间以第5天为最佳。而且,在添加苯丙氨酸和乙酸钠后的第3天收获细胞,此时细胞的生物量和甘草黄酮产量最大。此外,苯丙氨酸、乙酸钠的添加可以增加黄酮合成的关键酶之一——苯丙氨酸裂解酶的活性。酪氨酸对苯丙氨酸裂解酶影响不大,而肉桂酸的添加却导致其活性显著降低。

茉莉酸甲酯与二氢茉莉酮酸甲酯对悬浮培养的甘草细胞生长和黄酮积累的影响

建立了稳定的甘草细胞悬浮培养体系,在一个培养周期内,细胞的生长曲线呈"S"型,培养21d的干重、鲜重和黄酮产量都达到最高值。甘草细胞悬浮培养体系中分别添加100μmol·L-1二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯时,虽然对细胞生长有一定程度的抑制,但细胞中甘草黄酮产量仍有提高。添加二氢茉莉酮酸甲酯和茉莉酸甲酯的最适时间分别为细胞培养后的第5天和第10天。

甘草酸和甘草黄酮与人肝癌细胞(HepG2)作用的电化学研究

通过以人肝肿瘤细胞Hep G2为体外研究模型,采用了常见的电化学方法以及借助显微镜技术评估了甘草酸和甘草黄酮对它的影响,发现甘草酸在培养基中浓度低于2.0 g/L时,对肿瘤细胞的抑制效应比较小,当浓度扩大(大于2.0 g/L)时,抑制效应明显增大,细胞凋亡数目变化显著,并且在甘草酸浓度达到4.0 g/L之前,呈明显的浓度依赖性。而相同条件下甘草黄酮的抑制效应不大明显。通过本次研究,可以看出,甘草酸表现出了对肿瘤细胞Hep G2具有较明显的抑制作用。可以预见,作为一种比较常见的天然产物成分,它将在防癌抗癌药物的开发和研制当中得到人们的重视和应用。

外源水杨酸对悬浮培养甘草细胞中甘草黄酮积累的影响

甘草细胞悬浮培养体系中添加10 mg·L^(-1)水杨酸可促进和提高甘草细胞的生长和甘草总黄酮产量。添加水杨酸可导致细胞中过氧化氢含量升高,引起细胞中苯丙氨酸裂解酶、过氧化氢酶和过氧化物酶活性的增强以及丙二醛含量的升高。