大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因GmFAD3C在酿酒酵母中的表达

α亚麻酸(ALA)被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。ω-3脂肪酸脱氢酶(FAD)催化亚油酸(LA)生成ALA。大豆种子油中ALA含量较高,为了研究大豆ω3FAD的功能,用RTPCR方法从大豆未成熟种子中扩增出GmFAD3C的cDNA,克隆到酵母表达载体p416中,并用醋酸锂法转化酿酒酵母营养缺陷型K601,经筛选鉴定,得到阳性克隆。气相色谱分析脂肪酸成分,发现工程菌产生了新的脂肪成分ALA,含量占总脂肪酸的3.1%,LA含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的蛋白具有催化18碳多不饱和脂肪酸(PUFA)底物LA在Δ15位脱氢生成ALA的ω3FAD功能,首次实现大豆ω-3脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母K601p416系统中的表达,建立了一种新的高效低成本的FAD酵母表达系统。

大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3C-1基因的克隆及功能分析

研究通过对大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3家族中4个关键酶基因序列进行比对,与对照JN18相比,大豆低亚麻酸突变体MT72中GmFAD3C-1基因在起始密码子后+966bp处存在一个碱基位点的缺失(G→•),产生移码突变,导致氨基酸序列上产生较大变化(该突变基因命名为gmfad3c-1)。构建GmFAD3C-1基因超表达及CRISPR/Cas9编辑载体,利用花粉管通道法获得T_(2)转化植株。脂肪酸脱氢酶酶活测定结果显示,超表达植株T_(2)籽粒中,酶活与对照相比上升47.62%~78.85%,编辑载体T_(2)籽粒中,酶活与对照相比下降25.67%~47.11%。脂肪酸相对含量测定的结果进一步表明,GmFAD3C-1基因的表达与植株亚麻酸含量密切相关。

脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化分析

微体ω-3脂肪酸去饱和酶(Fatty Acid Desaturase 3,FAD3)是植物种子α-亚麻酸生物合成的关键酶。尽管很多FAD3基因被分离和鉴定,植物FAD3蛋白结构特征及遗传演化研究较少。为了探究脂肪酸去饱和酶FAD3蛋白特征及其在大豆中的遗传演化情况,本研究分析了37个物种(包括33种植物、2种蓝藻和2种真菌)的51个FAD3蛋白的序列特征和进化关系,并分析了大豆3个GmFAD3(GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C)基因在598份材料中的单倍型及其编码蛋白构象。结果发现,植物FAD3蛋白序列和结构较为保守,其进化关系与植物分化进程一致。GmFAD3A、GmFAD3B和GmFAD3C分别包含14,4和4种单倍型。GmFAD3A-1(Hap1/2)在各大豆种植区域均有分布,Hap3/4/5除华南和西北地区外,其他地区均有分布。虽然GmFAD3A-1(Hap1/2/4)和GmFAD3A-1(Hap3/5)编码蛋白构象差异较大,但可能与地理分布并无关联。而GmFAD3A-2(Hap1~5)编码蛋白构象基本相同,表明GmFAD3A-2可能并未受到选择。GmFAD3B(Hap1/2/4)中地方品种占比较高,其中Hap1/2在我国各大豆主要产区均有分布,而Hap3中改良品种占比较高(78.57%),仅分布在东北、华北和华东地区,表明GmFAD3B(Hap1/2/4)和GmFAD3B(Hap3)编码蛋白构象差异可能受地理因素影响的同时受到人工选择。GmFAD3C中Hap1占比极高(98.66%),在我国各大豆种植区域均有分布,说明该基因比较保守,可能在大豆脂肪酸去饱和过程中起到非常重要的作用。本研究为GmFAD3在大豆α-亚麻酸积累中的作用机制解析和高α-亚麻酸育种提供参考。