大豆转录因子GmNAC8的克隆及耐旱性功能分析

大豆转录因子GmNAC8在耐旱材料和敏感材料中明显差异表达,该基因CDS序列全长1 092bp,编码363个氨基酸残基。通过软件预测,蛋白质相对分子质量为41.82k D,等电点为8.51,其N-端含有42aa组成的NAC保守结构域,C-端高度变异。进化树分析表明,该蛋白与菜豆、红豆、绿豆同源关系最近。在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位分析表明GmNAC8蛋白定位于细胞核。转录水平表达分析表明,GmNAC8基因在转基因株系叶中的表达量要明显高于根中的表达量;GmNAC8基因受0.1mmol/L IAA和ABA诱导表达量显著上升,受GA和SA抑制。GmNAC8基因在拟南芥中超量表达可以使拟南芥叶片更绿,耐旱能力增强。抗旱生理指标检测表明,在干旱处理10d后,转基因拟南芥叶中蛋白质含量、脯氨酸含量、POD活性均高于野生型拟南芥,丙二醛含量明显低于野生型拟南芥,仅为42%。本研究结果为进一步研究GmNAC8在植物耐旱反应中的分子机理奠定基础。

大豆GmNAC8基因克隆与原核表达

为了进一步明确GmNAC8基因的功能,设计带有Nde I和Xba I双酶切位点引物,从大豆根系cDNA中克隆到GmNAC8基因全长ORF(Open reading frame),编码蛋白质分子质量为37 000,理论等电点为6.43。将扩增片段克隆至原核表达载体pCZN1,构建重组质粒pCZN1-GmNAC8,经过酶切和PCR验证,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,0.2 mmol/L IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳检测获得了目的蛋白质,该蛋白质主要以包涵体的形式存在,通过镍柱子纯化获得纯化蛋白质,然后利用His标签蛋白质作为抗体进行Western-blot分析,证明所纯化蛋白质为目的蛋白质。