大豆bZIP转录因子基因GmbZIP33的克隆与功能分析

碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)蛋白是真核生物所特有的一类转录因子,广泛参与植物生长、发育、生理代谢的调控过程。为探究大豆bZIP转录因子的功能,本研究通过PCR技术从大豆中克隆bZIP转录因子编码基因GmbZIP33(Glyma.03G219300.1),利用生物信息学方法对该基因及其编码的蛋白质进行分析,利用荧光定量PCR检测该基因的时空表达模式及其对逆境的响应能力,通过创制GmbZIP33过表达拟南芥植株分析其对植株表型与开花相关基因的影响。结果表明:GmbZIP33基因位于大豆第3号染色体上,编码区全长453 bp。GmbZIP33与bZIP转录因子家族的GmbZIP41序列同源性高达91.4%,属于S-bZIPs亚族成员。GmbZIP33响应高盐、干旱胁迫,其在叶片中表达量最高,且在短日条件下表现出明显的昼夜节律模式,推测其可能参与到光周期调控开花的复杂网络中。通过拟南芥植物异位过表达GmbZIP33发现,转基因拟南芥植株表现出早花表型且引起FT等开花相关基因表达量上升,说明GmbZIP33可参与到拟南芥的开花调控途径中并有效促进植物开花,本研究对深入理解GmbZIP33转录因子在植物生长发育过程中的多调控性能奠定了基础。

大豆GmbZIP基因家族鉴定分析

bZIP基因家族是最大的转录因子调控家族,在植物胁迫应答和生长发育等生理过程中发挥重要作用。此外,其在种子发育和营养阶段参与ABA调节的基因表达,为ABA抑制生长的主要介质。为探究GmbZIP基因家族在大豆籽粒生长发育及逆境响应过程中的作用,文章利用生物信息学软件对大豆GmbZIP基因家族在全基因组水平上进行鉴定,对其基因结构、定位信息、蛋白结构、保守基序、系统进化树、顺式作用元件、同物种内共线性关系和基因表达模式进行分析。结果表明,大豆GmbZIP基因家族包含6个成员,均等地分布在6条染色体上。亚细胞定位预测表明,大豆GmbZIP基因主要定位于细胞核中,其三级结构存在多处α-螺旋和β-转角。通过CDS长度和氨基酸一致性计算得到3对复制基因对,分别为Glyma.15G222400和Glyma.08G227000,Glyma.06G314400和Glyma.04G124200,Glyma.03G003400和Glyma.19G122800。系统进化树分析表明,不同植物的bZIP家族基因在进化树中分为2个主要分支,其中大豆与菜豆的亲缘关系较近。通过GmbZIP基因家族成员物种内共线性分析发现该基因家族发生了4次复制事件,表明在进化过程中大豆GmbZIP基因出现了基因分化。通过对GmbZIP基因家族在不同组织中的表达模式进行分析发现GmbZIP基因家族在籽粒中的表达量显著高于其他组织。通过启动子顺式作用元件分析发现GmbZIP基因家族成员对植物激素和植物抗逆存在潜在调控机制,且对光反应存在调控作用。

大豆GmbZIP16的抗旱功能验证及分析

【目的】通过分析干旱条件下大豆的转录组数据,筛选获得大豆锌指蛋白Gmb ZIP16,对其进行功能验证,确定Gmb ZIP16参与大豆抵抗干旱的分子机理。【方法】大豆干旱转录组数据分析得到上调倍数较高的锌指蛋白Gmb ZIP16,以大豆c DNA为模板克隆获得Gmb ZIP16。并通过In-Fusion连接酶技术,构建p CAMBIA1302-Gmb ZIP16和p CAMBIA3301-Gmb ZIP16表达载体。通过液氮冷冻法将重组载体p CAMBIA1302-Gmb ZIP16和p CAMBIA3301-Gmb ZIP16分别转入农杆菌GV3101和大豆发根农杆菌K599的感受态细胞中,通过农杆菌侵染拟南芥花序以及大豆子叶节技术,产生过表达拟南芥植株以及过表达大豆毛状根复合体植株。通过半定量RT-PCR和q RT-PCR分析,确定Gmb ZIP16在转基因拟南芥和大豆毛状根中能够超表达。分别将正常条件下生长2周龄的转基因和野生型拟南芥植株转移至含有不同PEG浓度(6%PEG和8%PEG)的MS0培养基上继续培养7 d,观察转基因拟南芥和对照野生型拟南芥之间的生物量差异;利用q RT-PCR分析转基因拟南芥和野生型拟南芥植物体中胁迫相关的基因表达情况。将生长良好的转Gmb ZIP16大豆毛状根复合体施加25%PEG处理1周后,分别采取转Gmb ZIP16大豆毛状根复合体和转空载体大豆毛状根复合体的叶片,用酶标仪测定植株的脯氨酸、丙二醛和叶绿素的含量。【结果】通过PCR技术扩增得到正确的Gmb ZIP16序列,通过农杆菌转化技术得到2个稳定过表达的转Gmb ZIP16拟南芥株系。通过对转基因拟南芥的表型鉴定发现转基因拟南芥在干旱处理下的生物量(鲜重和根长)及存活率比野生型显著提高。在过表达Gmb ZIP16拟南芥植株中,一些与胁迫相关的基因的表达要高于在野生型,如RD29B、DREB2A和P5CS。转Gmb ZIP16大豆毛状根复合体植株在25%PEG处理1周后,大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量要显著高于转空载体大豆毛状根复合体叶片中叶绿素和脯氨酸的含量,而转Gmb ZIP16大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量显著低于转空载体大豆毛状根复合体叶片中丙二醛的含量。【结论】在拟南芥中过表达大豆Gmb ZIP16提高了转基因拟南芥的抗旱性。过表达Gmb ZIP16可以提高转基因大豆毛状根复合体对干旱的抗性。Gmb ZIP16提高植物的抗旱性主要是通过影响与抗逆相关基因的表达来实现的。

大豆GmbZIP27基因的克隆及表达分析

bZIP蛋白是一类调控植物生长发育和抗性的转录因子。为探究大豆bZIP的生物学功能,利用PCR方法从大豆中克隆到1个bZIP基因GmbZIP27,对该基因进行生物信息学、表达模式和结合特异性分析。结果表明,GmbZIP27基因的开放阅读框长为825 bp,编码274个氨基酸,蛋白质分子质量为30.426 kD,等电点为8.54,含组氨酸和丝氨酸活性位点,为不稳定疏水蛋白,二级结构以α-螺旋和β-折叠为主。亚细胞定位分析发现GmbZIP27定位于细胞核。酵母单杂交实验表明GmbZIP27不能结合GmFBX176启动子中的ABRE元件。组织特异性表达模式表明,GmbZIP27在大豆组织中的相对表达量由高到低依次为子叶、根、叶和茎,推测GmbZIP27基因参与调控大豆的生长发育过程。本研究为深入解析bZIP转录因子在大豆发育及非生物胁迫应答中的功能提供一定理论依据。