表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒的构建与鉴定

为了构建出表达新布尼亚病毒(SFTSV)Gn基因的重组5型腺病毒,试验根据GenBank上发表的SFTSV Gn基因序列(登录号为ADZ04482.1)设计合成引物,采用特异性PCR方法在Gn基因前添加了KOZAK序列和tPA信号肽序列;然后通过酶切、连接等方法构建重组穿梭质粒PGA-KOZAK-tPA-Gn,与腺病毒骨架质粒pAd5-ΔE1ΔE3-5E4在BJ5183感受态细胞中进行同源重组,得到重组腺病毒质粒rAd5-KOZAK-tPA-Gn,用PacⅠ酶酶切重组腺病毒质粒,并将线性化的质粒转染至HEK 293细胞中进行病毒包装、扩繁和纯化;采用PCR扩增、Western-blot等技术检测病毒基因的表达情况,并测定重组腺病毒效价。结果表明:通过PCR扩增获得了1 546 bp的KOZAK-tPA-Gn基因,并成功构建了重组穿梭质粒;SFTSV Gn基因在重组腺病毒传代过程中稳定存在;重组腺病毒在HEK 293细胞中表达出分子量约为61 ku的SFTSV Gn蛋白;测得重组腺病毒效价为1×10^(-7.63)/0.1 mL TCID_(50)。说明试验成功构建出表达SFTSV Gn基因的重组5型腺病毒。

伪狂犬病病毒gN基因缺失株的构建及其在小鼠上的免疫效力分析

为了确定伪狂犬病病毒(PRV)gN基因的功能,以PRV-JSZ双基因缺失株rPRV-gE^-/TK^-和疫苗株Bartha K61为亲本株,通过同源重组技术构建这两种病毒的gN缺失株。PCR扩增鉴定和序列分析结果显示成功获得了gN缺失株rPRV-gE^-/TK^-/gN^-和rPRV-Ba-gN^-。与亲本株相比,rPRV-gE^-/TK^-/gN^-在PK15细胞上早期增殖速度较慢,但效价无明显变化;rPRV-Ba-gN^-在PK15细胞上的增殖速度和效价显著降低。rPRVgE^-/TK^-/gN^-和rPRV-gE^-/TK^-的LD_50均大于1×10~6 TCID_50,rPRV-Ba-gN^-的毒力低于Bartha K61。与亲本株相比,gN缺失株免疫小鼠可提供较好的抗体水平和攻毒保护率。PRV gN基因的缺失可进一步降低病毒的毒力,提高免疫保护力。

犬细小病毒南京株(CPV-GN)衣壳蛋白vp2基因的克隆与序列分析

通过对结构蛋白vp2基因序列的分析可以对犬细小病毒进行分型的确定。本文以常规PCR技术扩增犬细小病毒南京株CPV-GN衣壳蛋白VP2基因,并将之插入到pMD 18-T中,构建克隆载体pMD-vp2。经测序,目的片段长1548 bp,编码516个氨基酸与CPV-d、CPV-15、CPV-N等其它标准株和参考株进行序列比较,CPV-GN株vp2基因第1276碱基处发生了A→G替换,使天冬酰氨426变为天门冬氨酸,从而确定CPV-GN株为CPV-2b亚型;与其它CPV参考株CPV-2b亚型进行序列比较,CPV-GN株vp2基因第18、354、405、1465和1543碱基处的突变是独有的,在这几处分别发生了T→A、A→G、G→A、G→A和T→A替换前三处替换并未改变所编码的氨基酸,而第1465位的G→A点突变使缬氨酸489变为异亮氨酸,第1543位的T→A点突变使丝氨酸515变为苏氨酸,推测这两处的突变很可能与该病毒株的毒力特性有关。

番茄斑萎病毒YN-1株系G_N/G_C基因的克隆与分析

作者以TSWV YN-1株系为研究材料,克隆了其GN/GC基因,测序后与GenBank中TSWV其他株系GN/GC基因进行比对,结果显示:YN-1GN/GC基因全长3 408bp,编码1 135个氨基酸,构建的系统发育树可分为4个群,YN-1属于群Ⅱ,与源自西班牙的SPAIN-2株系的GN/GC基因核苷酸相似性最高,达98.88%,氨基酸相似性达98.85%。YN-1株系N基因和GN/GC基因的起源不同,我们推断YN-1可能是一个发生重排(reassortment)的新株系,是不同地理起源的株系在共同传播过程中发生了重排的结果,具体原因有待进一步研究。

犬细小病毒南京株VP2蛋白免疫原性片段的克隆表达

以Protean软件对犬细小病毒南京株(CPV-GN)VP2蛋白的分子结构进行分析,从中筛选出具有良好免疫原性潜能的部分片段(VP2′片段),利用PrimerPremier5.0软件设计一对引物,用以该片段的扩增。将PCR扩增产物克隆入pMD18-T载体,构建了pMD-VP2′重组质粒。双酶切回收目的条带,将之亚克隆入表达载体pET32a(+),构建了重组表达质粒pET32-VP2′。转化宿主菌BL21,经IPTG诱导后成功表达了分子量约为34ku的融合蛋白。免疫转印显示,目的蛋白可被CPV-2b抗血清所识别,证明其具有与特异性抗体结合的抗原性,为CPV亚单位疫苗和免疫学诊断方法的研究打下基础。

牛传染性鼻气管炎病毒(gN-TK-gG-)三基因缺失突变株的构建

牛传染性鼻气管炎是由牛疱疹病毒I型（BoHV-1）引起的一种牛的传染病，可导致严重的经济损失。疫苗接种是用于防控该病的重要手段，但现有疫苗在多个方面都有改进的余地。本试验利用pBoHV-1 BAC载体和4次Red E／T重组，依次构建了BoHV-1 gN^-（CT^-）、BoHV-1 gN^-（CT^-30-32^-）、BoHV-1 gN^-TK^-和BoHV-1 gN TK gG^-基因缺失突变株，其中gN缺失了胞外区30-32位氨基酸、胞质尾区CT端，TK基因缺失了1079bp，gG基因缺失了1335bp。pBoHV-1 gN^-TK^-gG^-经磷酸钙法转染MDBK细胞后，出现细胞病变，成功拯救出三基因缺失病毒株BoHV-1 gN TK^-gG^-。研究结果为牛传染性鼻气管炎新型基因缺失标记疫苗的开发奠定了基础。

疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的研究进展

gN蛋白是疱疹病毒gN基因编码的一种糖蛋白,其氨基酸组成的种类及数量在不同疱疹病毒中略有差异。目前已有研究表明gN蛋白定位于宿主细胞细胞质,主要分布于内质网区域。该蛋白在宿主细胞中与疱疹病毒gM蛋白形成复合物,参与病毒复制和细胞间感染过程,并对宿主细胞有免疫逃避作用。对疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的特点和功能的总结,为进一步开展对疱疹病毒gN基因的深入研究提供一定的理论依据。