裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的表达、纯化及抗原性分析

目的通过原核表达系统制备裂谷热病毒Gn片段主要抗原区蛋白,获取纯化蛋白,并分析抗原性。方法将合成的裂谷热Gn基因用PCR的方法扩增具有保护性抗原表位的两段Gn1和Gn2,并将其定向插入原核表达质粒pColdⅠ中,构建重组表达质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2,并将重组质粒转化到BL21(DE3)感受态中,以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达蛋白和表达量,并利用His-tag Ni柱进行亲和层析纯化,Western-blot鉴定表达蛋白。结果所构建的质粒pColdⅠ-Gn1和pColdⅠ-Gn2序列正确,SDS-PAGE检测到目的蛋白,Western-blot显示截断的Gn蛋白具有很好反应原性。结论成功纯化了裂谷热病毒Gn主要抗原区的表达蛋白。

番茄环纹斑点病毒Gn蛋白的原核表达及多抗血清制备

通过生物信息学预测,番茄环纹斑点病毒(Tomato zonate spot virus,TZSV)Gn蛋白为跨膜蛋白,有3个跨膜结构域,抗原表位预测发现非跨膜区包含有较高的抗原指数区域,因此选择Gn蛋白的非跨膜区进行原核表达及多抗血清制备。用特异性引物,通过RT-PCR从感染TZSV的番茄中扩增出部分Gn基因片段,将获得的片段构建到原核表达载体pET-30a中,获得原核表达载体pET-30a-Gn,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳分析显示,高效诱导表达了40 kD融合蛋白。用回收纯化的融合蛋白免疫家兔,获得多抗血清。间接ELISA测定多抗血清的效价为1/16 384。利用制备好的抗血清对感染TZSV的病样进行Western blotting检测,能检测到特异性条带。结果表明该抗血清特异性良好,可用于TZSV Gn相关的免疫反应实验。

裂谷热病毒Gn蛋白主要抗原区的串联表达和多克隆抗体制备

裂谷热(Rift Valley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)引起的一种烈性人兽共患传染病。RVFV囊膜蛋白Gn可诱导产生中和抗体,是RVFV检测方法和疫苗研究的重要抗原靶标。本研究通过分析蛋白抗原位点信息,构建包含Gn蛋白两个主要抗原区域的重组表达载体,随后将质粒转化至BL21感受态细胞,以IPTG诱导重组蛋白表达并优化蛋白表达条件,通过Western Blot鉴定重组蛋白;将重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,并以ELISA、Western Blot、IFA检测多克隆抗体的反应性。结果显示:诱导表达的Gn重组蛋白分子质量约为45 kDa;蛋白表达条件优化为IPTG终浓度0.25 mmol/L,诱导时间5 h;Western Blot鉴定发现蛋白成功表达。通过ELISA测定小鼠三免后血清抗体,结果发现抗体效价大于1:51200;Western Blot检测显示,制备的多抗血清能与重组蛋白发生反应;进一步的IFA检测结果表明,制备的多克隆抗体可与真核质粒转染细胞中表达的Gn蛋白反应。本研究获得的Gn重组蛋白及制备的多克隆抗体为后续RVFV检测方法的建立奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征病毒Gn蛋白的表达及其免疫原性

目的通过9型腺相关病毒(adeno-associated virus 9,AAV9)系统表达发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)Gn蛋白,并评价其免疫原性。方法将SFTSV Gn基因重组至病毒载体pAAV-CMV-FH,将构建的重组质粒转染HEK293T细胞,获得重组病毒AAV9-Gn;免疫荧光和Western blot法鉴定Gn蛋白的表达情况。将18只雌性BALB/c小鼠随机分为Mock组(无血清DMEM)、AAV9-GFP组(1×10^(11)vg)和AAV9-Gn组(1×10^(11)vg),各组均经小鼠右后肢肌内注射,100μL/只。连续21 d监测各组小鼠体质量、饮食、行为及精神状态,并计算体质量变化率;于免疫后2、4、8、16周,采用荧光灶减少中和试验(fluorescent reduction neutralization test,FRNT)检测各组小鼠血清中SFTSV中和抗体水平,ELISA法检测AAV9-Gn组小鼠血清中特异性IgG1和IgG2a抗体水平。结果与特异性抗体孵育显色后,转染AAV9-Gn的Vero细胞于荧光显微镜下可见特异性绿色荧光,且可与小鼠抗SFTSV Gn单克隆抗体发生特异性结合,并于相对分子质量约61000处可见特异性结合条带。3组小鼠体质量均呈增长趋势,组间差异无统计学意义(F=0.158~2.621,P>0.05),且饮食、行为及精神状态均表现正常。免疫后2、4、8和16周,AAV9-Gn组小鼠血清中的SFTSV中和抗体效价均明显高于Mock组和AAV9-GFP组(H=13.332~14.538,P均<0.001),且效价峰值出现在第8周;不同时间点小鼠血清中特异性IgG1抗体水平均明显高于IgG2a(F=4.373~12.975,P均<0.05)。结论通过AAV9表达系统可正确表达SFTSV Gn蛋白,且对小鼠毒性较低,并具有良好的免疫原性,有望作为SFTSV疫苗的候选成分。

番茄斑萎病毒核衣壳蛋白N及膜多糖蛋白Gn的多克隆抗体制备及应用

由番茄斑萎病毒Tomato spotted wilt orthotospovirus (TSWV)侵染引起的番茄斑萎病毒病在我国蔬菜、花卉等作物上造成了严重的经济损失。本研究克隆了TSWV核衣蛋白N基因及膜多糖蛋白Gn基因,利用Gateway系统获得N和Gn基因的原核表达载体。将其转化到大肠杆菌表达菌株Rosetta (DE3)细胞内,IPTG诱导表达N蛋白和Gn蛋白,以此为抗原分别免疫新西兰大白兔,制备N蛋白和Gn蛋白的多克隆抗体。Western blot检测结果表明,N蛋白的多克隆抗体能够与N蛋白发生特异性结合反应,间接酶联免疫吸附(indirect enzyme-linked immunosorbent assay,in-ELISA)分析检测表明抗体滴度为1∶12 800,而Gn蛋白的多克隆抗体特异性差,效价未检出。本研究制备的N蛋白多克隆抗体可用于田间病株的病害诊断,同时有助于开展病毒在介体昆虫内定位、病毒和介体昆虫互作及功能分析的研究。

表达SFTSV Gn蛋白的重组狂犬病病毒的构建、鉴定与免疫反应

目的构建表达发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV) Gn蛋白的重组狂犬病病毒,并研究重组病毒的免疫反应。方法将SFTSV的保护性抗原Gn蛋白基因插入至狂犬病病毒(RABV) SAD株基因组的假基因区,通过反向遗传技术拯救获得重组病毒SAD-Gn株。对SAD-Gn进行生物学特性鉴定,并将SAD-Gn株免疫小鼠,测其血清中和抗体效价。结果通过酶切、RT-PCR和荧光抗体染色鉴定,证明SAD-Gn株基因组中含有Gn基因,且能正确表达Gn蛋白。该重组病毒细胞适应性好,滴度可达3. 3×108FFU/ml。免疫小鼠后,可同时诱导产生高效价的抗RABV和SFTSV的中和抗体。结论成功构建了重组病毒SAD-Gn,并诱导小鼠产生针对RABV和SFTSV的中和抗体,为进一步研制预防狂犬病和发热伴血小板减少综合征的二联疫苗奠定了基础。

发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒Gn和Gc蛋白的分段表达

目的分段表达发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(SFTSV)Gn和Gc蛋白。方法采用PCR方法克隆了SFTSV Gn和Gc基因上三段相互重叠的基因片段Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3,将PCR产物分别连接到原核表达载体pET28a(+)上,经酶切、PCR、测序鉴定,获得重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),将其分别转化感受态菌BL21,IPTG诱导表达,通过Western blot鉴定Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2、Gc3蛋白的表达。结果成功构建重组质粒pET28a-Gn(Gn1)、pET28a-Gn(Gn2)、pET28a-Gn(Gn3)、pET28a-Gc(Gc1)、pET28a-Gc(Gc2)、pET28a-Gc(Gc3),Western blot可见Gn1、Gn2、Gn3、Gc1、Gc2和Gc3编码蛋白的成功表达。结论 Gn和Gc蛋白的分段表达成功,为进一步深入研究SFTSV的Gn和Gc蛋白结构与功能及精确定位其抗原表位奠定了基础。

SFTSV糖蛋白Gn重组质粒的构建及其体液免疫原性研究

目的 :研究严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)糖蛋白Gn的体液免疫原性。方法:将PCR方法扩增的SFTSV糖蛋白Gn基因和密码子优化后Gn基因克隆入载体p JW4303,构建Gn野生型和双优化重组质粒;经酶切和测序鉴定确认为目的质粒后,分别转染HEK293T细胞,Western blot检测糖蛋白Gn的表达;用Gn重组表达质粒及空载体分别免疫BALB/c小鼠,ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性Ig G抗体。结果:成功构建Gn重组野生型质粒p JW4303-WSP-Gn和双优化质粒p JW4303-t PA-Gn-opt;Western blot证实p JW4303-WSP-Gn编码Gn可在HEK293T细胞内表达,p JW4303-t PA-Gn-opt编码Gn在HEK293T细胞内表达并分泌到细胞外;ELISA检测免疫后小鼠血清抗Gn特异性Ig G抗体证实各重组质粒均能诱导特异性Ig G抗体产生,双优化质粒较野生型质粒诱导产生的Ig G时间更早、滴度更高。结论:SFTSV的糖蛋白Gn具有良好的免疫原性;和野生型质粒相比,双优化质粒更有利于糖蛋白Gn的表达和分泌,并且具有更好的体液免疫原性。

裂谷热病毒Gn1蛋白在杆状病毒系统中的表达与纯化

采用杆状病毒表达系统表达并纯化裂谷热病毒(RVFV)Gn蛋白,并对其反应原性进行鉴定。根据GenBank公布的Gn蛋白的序列,选取其主要抗原区Gn1设计引物进行PCR扩增,将扩增产物克隆至pFastBac HTB载体,构建重组转移载体,并将其转化DH10Bac感受态细胞进行蓝白斑筛选。将鉴定正确的重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒,经SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白正确表达后,将重组杆状病毒感染High5细胞,大量表达重组蛋白,并用镍柱亲和层析法进行纯化,最终获得纯度较高的Gn1重组蛋白。本研究为RVF新型疫苗研发及诊断试剂的研发提供了重要材料。

抗严重发热伴血小板减少综合征病毒包膜糖蛋白单链抗体的筛选和鉴定

目的筛选及表达抗严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)包膜糖蛋白(Gn)单链抗体(scFv)。方法利用人源化SFTSV的scFv文库与固相化包被的SFTSV-Gn蛋白特异性结合,经过4轮"吸附-洗脱-扩增"筛选能特异性结合SFTSV-Gn蛋白的噬菌体scFv,随机挑取最后一轮单菌落进行噬菌体-ELISA鉴定,将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中原核表达,用Western blot法鉴定scFv的表达, ELISA鉴定纯化后scFv的结合活性。结果筛选出3株不同序列的抗SFTSV-Gn蛋白的scFv, Western blot法结果显示scFv得到正确表达, ELISA结果显示纯化后的scFv具有结合活性。结论成功筛选及表达了抗SFTSV-Gn蛋白的scFv。

新型布尼亚病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

目的本研究旨在建立新型布尼亚病毒抗体检测的高特异性、低成本间接ELISA方法。方法通过优化抗原表达、纯化、包被、血清稀释、孵育时间等条件,以Gn的截短蛋白Gn2为包被抗原,开发了一种间接ELISA方法。检测该方法的稳定性、敏感性、特异性、符合率。结果批内和批间变异系数均小于10%,阳性血清临床符合率达76.9%(10/13),阴性血清临床符合率达86.7%(26/30)。结论本研究所建立的间接ELISA方法可用于临床血清样品的检测,为发热伴血小板减少综合征的疾病诊断和监测提供了较为可靠和廉价的检测方法。

缺失gE基因的牛Ⅰ型疱疹病毒构建及其体外增殖特性比较

为构建gE基因缺失的牛Ⅰ型疱疹病毒(BHV1),本研究在BHV1全基因组感染性细菌人工染色体克隆pBHV1-ZJ的基础上,利用Red E/T重组技术,分别构建了gE基因缺失、gE和gN双基因缺失的pBHV1突变体,通过转染获得了重组病毒rBHV1-△gE,而双基因缺失突变体pBHV1-△gN-△gE则未能观察到细胞病变。病毒噬斑大小和生长曲线试验表明,在感染细胞内和培养基中,rBHV1-△gE滴度与亲本毒株BHV1无明显差异,而rBHV1-△gN显著降低;重组病毒rBHV1-△gE和前期构建的rBHV1-△gN形成的噬斑均显著小于亲本病毒,其大小分别为亲本病毒的18%和64%。rBHV1-△gE和rBHV1-△gN的构建将有助于阐明gE与gN协同作用机制和为研制BHV1新型基因标记疫苗奠定基础。

疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的研究进展

gN蛋白是疱疹病毒gN基因编码的一种糖蛋白,其氨基酸组成的种类及数量在不同疱疹病毒中略有差异。目前已有研究表明gN蛋白定位于宿主细胞细胞质,主要分布于内质网区域。该蛋白在宿主细胞中与疱疹病毒gM蛋白形成复合物,参与病毒复制和细胞间感染过程,并对宿主细胞有免疫逃避作用。对疱疹病毒gN基因及其编码蛋白的特点和功能的总结,为进一步开展对疱疹病毒gN基因的深入研究提供一定的理论依据。

牛Ⅰ型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性

通过同源重组将pHA2质粒插入到牛Ⅰ型疱疹病毒ZJ分离株基因组的UL15和UL18基因之间,构建了重组病毒rBHV1-HA;提取重组病毒的环状基因组DNA,转化大肠杆菌DH10B,获得了含有BHV1全基因组的感染性细菌人工染色体克隆pBHV1.pBHV1转染MDBK细胞可以拯救出病毒,该病毒与野生毒株在细胞上的繁殖特性未见差异.通过两步Red E/T重组,构建了gN基因跨膜区缺失的pBHV1突变体,并转染获得了重组病毒rBHV1-△gN.病毒繁殖动态曲线显示,rBHV1-△gN的滴度比野生毒株低9%～20%.BHV1感染性克隆的成功构建,将为研究新型BHV-1基因缺失疫苗和牛的病毒载体疫苗提供技术平台.