西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA的克隆与序列分析

参照GenBank登录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列设计引物,以新生5d的西农萨能羊皱胃组织总RNA为模版,通过RT-PCR方法获得凝乳酶原前体cDNA,克隆测序后进行序列比对。结果表明,克隆基因为B型凝乳酶,该基因cDNA具有1292个碱基,编码381个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽序列和42个氨基酸的酶原序列。将其与已报道的山羊、绵羊和牛的凝乳酶原前体序列进行比对,发现核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%和95.29%,氨基酸同源性为99.21%、98.42%和93.70%。

西农萨能羊凝乳酶原基因的克隆与原核表达

【目的】克隆西农萨能羊凝乳酶原基因并进行原核表达,对表达产物凝乳酶原复性后进行活性检测,为西农萨能羊凝乳酶制剂的微生物发酵生产奠定基础。【方法】从西北农林科技大学西农萨能羊原种场新生公羔羊的皱胃组织中提取总RNA,通过RT-PCR方法获得西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,纯化后与pMD-18T载体连接,转化大肠杆菌JM109,通过双酶切和序列测定,获得了凝乳酶基因全长编码区序列。将该基因连接到原核表达载体pET-30a中,构建重组菌pET-30a/Chymosin,经酶切、测序鉴定后进行凝乳酶的小量表达、大量表达、Western杂交鉴定、纯化、复性和活性测定。【结果】通过RT-PCR方法获得了西农萨能羊凝乳酶原前体的编码序列,并构建了重组菌pET-30a/Chymosin;通过体外原核表达获得了西农萨能羊凝乳酶原,将酶原进行复性后测得重组菌酶活力为93.2U/mL。【结论】利用西农萨能羊凝乳酶原基因,通过构建原核表达载体和体外表达可以得到凝乳酶原,通过蛋白纯化和复性可得到有活性的凝乳酶。

不同泌乳期羊乳的理化特性及其酶凝固特性

以不同泌乳期羊乳为原料,研究其基本理化特性(色泽、膻味、p H值、酸度、密度、乳化学成分)及酶凝固特性(硬度、内聚性、弹性)和持水力,以便为羊乳制品的开发提供更适宜的生产原料。结果表明,不同泌乳期羊乳的各理化特性和酶凝固特性差异较大。随着泌乳期的延长,羊乳由乳黄色逐渐变为乳白色,其膻味逐渐变淡,p H值缓慢上升,而酸度、密度、乳化学成分含量及酶凝固特性、持水力均呈下降趋势。经综合分析,建议将泌乳第120~150天的羊乳作为稀奶油生产的较优质原料;泌乳第4~150天的羊乳更适合用于凝固型酸奶和奶酪的加工;而泌乳第7~240天的羊乳均可用于生产液态羊乳或羊乳粉,但需要对其主要化学成分进行标准化处理。

重组山羊凝乳酶的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 原核表达纯化山羊凝乳酶(CYM)蛋白,制备针对凝乳酶蛋白的多克隆抗体并进行抗体验证。方法 将pET-32a-TEV-CYM重组质粒转化至表达菌Escherichia coli BL21(DE3),用IPTG诱导重组凝乳酶蛋白表达,并通过镍柱亲和层析纯化、TEV酶酶切等方法获得凝乳酶蛋白。将纯化的凝乳酶蛋白免疫新西兰大白兔,以获得针对凝乳酶蛋白的多克隆抗体。通过ELISA检测凝乳酶抗体与重组凝乳酶蛋白的特异性免疫反应。结果 重组凝乳酶蛋白可被IPTG诱导表达,亲和层析纯化获得高纯度的凝乳酶蛋白。该蛋白在新西兰大白兔体内能够诱导产生多克隆抗体,且能与重组凝乳酶蛋白特异结合。结论 成功原核表达纯化出重组凝乳酶蛋白并制备相应兔多克隆抗体,为后续开发天然凝乳酶含量检测试剂盒提供了基础。