Isolation, Purification and Cryopreservation of Cells from Neonatal Bovine Testis

The development and application of spermatogonial stem cell technology have an important significance in animal cloning, preservation of endangered species and spermatogenesis research. In this study, the seminiferous epithlium cells were isolated and purified, the ceils were cryopreserved after identification, and the effects of different purification and cyopreservation methods on bovine testicular cells were studied. The results showed that there were spermatogonial stem cells and sertoli cells in the neonatal bovine seminiferous tubules, differential adherent selection methods could effectively separate these two cell types. Spermatogonial stem cells were positive after AKP, C-kit, and OCT-4 identification; sertoli ceils were positive after oil red O and vimentin identification. Frozen stock solution supplemented with 10% DMSO had the best effect in spermatogonial stem cell cryopreservation, while fxozen stock solution supplemented with 10% of ethylene glycol and 0.1 mmol. L^-1 trehalose had the best effect in sertoli cells crvooreservation.

新生牛睾丸细胞的分离纯化与冷冻保存

以新生牛作为实验动物,取睾丸进行制样组织学观察,并将睾丸消化成单细胞悬液,对生精上皮细胞进行分离纯化、细胞鉴定及冷冻保存,研究不同分离纯化及冷冻保存方法对睾丸细胞的影响。结果表明,新生牛曲细精管中含有精原干细胞和支持细胞,差速贴壁法能有效分离两种细胞;精原干细胞鉴定,AKP、C-kit、OCT-4均呈阳性;支持细胞鉴定,油红O、波形蛋白均呈阳性。精原干细胞冷冻保存以10%的二甲基亚砜为冷冻剂的效果最好,支持细胞冷冻保存以10%乙二醇和0.1 mmol.L-1海藻糖组合效果最好。

山羊类ES细胞的分离与克隆

采集山羊交配后 6～ 8d的桑椹胚、囊胚和孵化囊胚 ,将桑椹胚和囊胚分别放在小鼠原代胎儿成纤维细胞(PMEF)饲养层和同源原代胎儿成纤维细胞 (PGEF)饲养层上比较其脱带时间及脱带率。脱带后 ,将各自一半胚胎切割 ,把含 ICM的半胚分别放在相应饲养层上进行培养 ,另一半整胚在各自饲养层上继续培养 ,而孵化囊胚直接于PGEF饲养层上培养。当 ICM增殖一定程度时进行传代 ,以比较其类 ES细胞分离与克隆的效果。结果表明 ,在 2种不同饲养层上 ,囊胚的脱带时间均短于桑椹胚 ,囊胚的脱带率均高于桑椹胚 ,而饲养层的种类对胚胎的脱带时间以及脱带率影响不大。脱带切割囊胚不论在 PMEF还是在 PGEF饲养层上 ,其贴壁时间均短于脱带整胚及孵化囊胚 ,而贴壁率高于脱带整胚 ,与孵化囊胚相似。脱带整胚及脱带切割胚在 PMEF饲养层上所获类 ES细胞只能维持 3代 ,而在PGEF饲养层上 ,脱带切割半胚和孵化囊胚所获类 ES细胞传至 5代。由此认为 ,对脱带后的胚胎进行切割处理 ,有利于 ICM的贴壁和增殖 ;应用同源原代胎儿成纤维细胞饲养层培养系统 ,有利于类

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的 探讨成体表皮干细胞体外分离、培养和鉴定的技术方法。为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法 通过中性蛋白酶消化成人包皮获得表皮细胞，再通过胰蛋白酶与乙二胺四乙酸（EDTA）消化并制成单个表皮细胞悬液，接种至人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内．以Dulbecco改良Eagle培养基／F12（DMEM／F12，1：1）作为表皮干细胞培养基置培养箱内培养，37℃静置10～l5min，留用快速贴壁细胞继续培养，所得细胞分别以能否呈克隆状生长、流式细胞仪测细胞周期、透射电镜观察其超微结构及β1-整合素、角蛋白19（K19）免疫细胞化学染色进行鉴定。结果 人胎盘Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞继续培养24h后细胞呈克隆状生长；电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征；细胞周期分析示，第2代中静息期／DNA合成前期（G0／G1期）细胞占86．83％。β1-整合素、K19免疫细胞化学染色呈阳性。结论 成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。

山羊精原干细胞的分离纯化及鉴定

旨在探究1种简便高效分离纯化山羊精原干细胞的方法。采用三步酶消化对4月龄的山羊睾丸进行处理,分离获得单细胞悬液。将细胞依次培养于明胶、大鼠鼠尾胶原和层粘连蛋白涂层的细胞培养皿中,根据各类细胞贴壁能力和贴壁速度不同进行精原干细胞的富集和纯化,并在各步纯化过程中用精原干细胞特异标记分子PLZF和CDH1进行免疫荧光标记染色鉴定,统计精原干细胞所占的比率,并对获得的细胞进行初步培养和鉴定。每克睾丸中分离出1.36×107个细胞。纯化后每克睾丸组织获得8.7×104个细胞,其中精原干细胞纯度达87.0%。将分离纯化后的细胞在体外培养可形成细胞簇,并表达精原干细胞标记分子CDH1和PLZF。结果表明,通过三步酶消化和差异贴壁方法已经建立起山羊精原干细胞的分离纯化技术。用此技术纯化的山羊精原干细胞(SSCs)能在体外培养增殖,形成细胞簇。

免疫磁珠法分离和纯化人胚胎神经干细胞

目的:建立有效的人类神经干细胞分离纯化系统和方法。方法:无菌取孕24周流产胎儿的室下区脑组织,制备细胞悬液,用磁性微珠标记的CD133单克隆抗体与细胞孵育,通过磁分选器分离出CD133(+)和CD133(-)细胞,通过体外培养并诱导分化,观察CD133阳性细胞和阴性细胞的增殖情况及分化能力。结果:经免疫磁珠分选的室下区脑组织中,CD133(+)细胞占胚胎脑组织细胞的2％左右,该细胞体外扩增能力强,细胞呈球形生长,并易聚集成团,培养5 d、10 d、15 d、20 d进行活细胞计数,细胞增长率分别为1.79％、4.82％、7.21％、14.66％,诱导分化后的细胞经染色鉴定可分化为神经元、神经胶质等多种神经细胞;阴性细胞扩增能力弱,活细胞计数以死细胞数量居多,大约70％,另外一些细胞贴壁分化。结论:免疫磁珠法简便、有效,经免疫磁珠分离的神经干细胞在体外能进一步培养扩增并分化。

大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与初步鉴定

目的 探讨体外分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)的方法 ,分析其部分表型特点。方法 用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓MSCs,传代扩增 ,测定生长曲线 ,形态学观察 ,免疫细胞化学及图像分析测定细胞表面抗原和细胞外基质蛋白表达情况。结果 MSCs属骨髓中单个核细胞 ,密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓MSCs,MSCs在含 10 %小牛血清的L DMEM中生长性状相对稳定 ,1、 3、 5代细胞生长曲线基本一致 ,增殖速度快。细胞呈均一的成纤维细胞样 ,均一表达CD4 4、CD5 4、纤维粘连蛋白 (Fibronectin ,FN)、Ⅰ型胶原 (CollagenⅠ )。结论 本实验建立了一种体外分离纯化、培养扩增大鼠骨髓MSCs的方法 ,MSCs稳定表达CD4 4、CD5 4、FN、CollaganⅠ。

山羊类胚胎干细胞的分离、克隆研究

从胚胎发育阶段、饲养层、生长因子等方面对影响山羊胚胎干细胞的分离、克隆的因素进行了研究。结果表明 :囊胚期可作为分离山羊胚胎干细胞收集胚胎适宜阶段 ;小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF)和山羊胚胎成纤维细胞 (GEF)对山羊类ES细胞分离效果影响不明显 ;生长因子LIF和SCF配合使用可分离到山羊的类ES细胞 ,并传至第 4代。

表皮干细胞的分离、纯化培养及鉴定初报

采用酶消化法和组织块法对小鼠、奶山羊、奶牛和家猪的表皮干细胞进行了分离、培养。结果表明:酶消化法适于小鼠表皮干细胞的分离,所获得的小鼠表皮干细胞在维持了两代之后自发分化为神经样细胞;奶山羊和奶牛不论用酶消化法还是组织块法都可以获得大量活力相对较好、表皮干细胞特性维持较久的细胞,奶山羊表皮细胞采用型胶原分选,用有血清培养液培养,经免疫细胞化学鉴定为表皮干细胞,可持续传至少9代,随着代数增高,细胞活力减弱。

人表皮干细胞的快速分离培养及鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外快速分离和培养方法。方法运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。分离的表皮片经表皮干细胞培养基(ESCM)悬浮,接种于IV型胶原包被的培养板中,37℃、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内静置培养10min,留用贴壁细胞;Ⅳ型胶原黏附、分离并富集后继续培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞,且克隆维持时间较长;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论运用Ⅳ型胶原黏附结合ESCM培养可以实现人成体表皮干细胞的快速分离和培养。

鼠口腔黏膜上皮干细胞的分离培养与鉴定

目的探索和建立鼠口腔黏膜上皮干细胞体外分离与培养的技术方法。方法利用纤维结合素-胶原包被的培养瓶快速黏附法分离鼠口腔黏膜上皮干细胞,以鼠成纤维细胞条件培养基和无钙EMEM培养基配制表皮干细胞培养基进行培养。通过β1整合素和角蛋白15(K15)免疫组化染色对培养细胞进行鉴定。结果鼠口腔黏膜上皮干细胞呈明显克隆性生长,β1整合素和角蛋白15(K15)免疫组化染色呈强阳性。结论利用纤维结合素-胶原包被的培养瓶快速黏附法分离鼠口腔黏膜上皮干细胞,用鼠成纤维细胞条件培养基和无钙EMEM培养基配制的表皮干细胞培养基进行培养,可以初步实现对鼠口腔黏膜上皮干细胞体外分离与培养。

人表皮干细胞的体外培养与鉴定

目的探讨人表皮干细胞的体外分离培养方法,并对培养的表皮干细胞进行鉴定。方法运用中性蛋白水解酶和胰蛋白酶两步法分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性黏附分离角质形成细胞,应用表皮干细胞培养基进行培养。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,免疫组织化学染色观察表皮干细胞β1整合素、角蛋白19(K19)、CK10的表达。结果组织学观察显示,培养中实验组细胞呈现克隆生长,且克隆维持时间较长;免疫组织化学染色显示,实验组的培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达,而CK10阴性表达。结论应用Ⅳ型胶原黏附和运用表皮干细胞培养基可以实现人体表皮干细胞的分离和培养,为表皮干细胞体外的大量扩增奠定了基础。

差速粘附方法分选表皮干细胞及其评价

目的 评价细胞外基质差速粘附法在分选表皮干细胞中的作用。方法 人角质形成细胞接种在Ⅳ 型胶原涂被的培养皿上进行粘附试验。粘附细胞为实验组,未粘附细胞及未分选的细胞分别为对照组1和对照组2。三组细胞分别进行克隆形成率测定、细胞周期测定和细胞超微结构观察;应用免疫细胞化学、免疫荧光和流式细胞仪检测β1整合素、细胞角蛋白K19、外皮蛋白(Involucrin)等标记物的表达。结果 与对照组1相比,实验组细胞较小,细胞表面的微绒毛较长而密。实验组细胞克隆形成率明显高于对照组1(P<0.05)。β1整合素、K19、Involucrin在不同组别和不同代次的细胞间表达有显著差别。细胞周期分析显示,实验组细胞86.9％处于G0/G1,8.8％在S期。对照组1和对照组2的细胞处于G0/G1期分别为74％和79.5％,处于S期分别为19.2％和12.3％。结论 细胞外基质差速粘附法可用于分选表皮干细胞。但要达到较高纯度,还需辅以其它手段。

新生牛雄性生殖干细胞的分离纯化与培养

为建立新生牛雄性生殖干细胞的体外增殖与分化体系,将新生牛睾丸消化成单细胞悬液,分别进行差速贴壁、不连续密度梯度Percoll分选雄性生殖干细胞和支持细胞,对分选生殖干细胞进行体外培养。结果表明,差速贴壁法能有效分选雄性生殖干细胞与支持细胞,2%血清浓度的培养液即可用于雄性生殖干细胞的体外培养,添加100 ng·mL-1的GDNF能显著促进雄性生殖干细胞的增殖,增殖形成的雄性生殖干细胞集落具有一定多能性。

成体表皮干细胞的分离培养与鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:运用DispaseⅡ酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离获得表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况;检测细胞克隆形成率及克隆维持时间;免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达。以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及K19均呈阳性表达。结论:成体表皮干细胞在体外得到成功分离与培养。

大鼠表皮干细胞的分离培养

为探索一种简单而又高效的分离大鼠表皮干细胞（ESCs）的方法,采用酶消化法和组织块法对大鼠表皮干细胞进行分离、培养;并用Ⅳ型胶原快速黏附法筛选大鼠表皮干细胞,免疫组织化学方法检测CK15、P63、β1-integrin和α6-integrin表达情况;同时,测定ESCs单细胞克隆与克隆形成率及表皮干细胞生长曲线。结果表明,采用组织块法和酶消化法均能分离得到大鼠表皮干细胞,获得的细胞生长良好,具有较高的克隆形成率,前者可传至第6代,而后者传至3代~4代便分化;干细胞标记物CK15、P63、β2-integrin和α6-integrin均呈阳性;酶消化法和组织块法均能成功地分离、纯化和培养大鼠表皮干细胞,组织块法相对较好。

兔骨髓间充质干细胞分离培养后的活力检测

背景:目前分离纯化骨髓间充质干细胞多采用单一的方法,对扩增培养过程中细胞活力的变化没有较为系统而全面的评估。目的:探索体外分离培养和纯化兔骨髓间充质干细胞的方法,并对细胞的活力进行检测。方法:采用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,从形态学、细胞表型和成骨成脂能力方面进行鉴定;并从细胞生长曲线、贴壁率和克隆形成率3个方面评估细胞活力。结果与结论:原代细胞多呈梭形和圆形,48h后大部分细胞贴壁,8-10d细胞融合达80%-90%,传代周期为3-5d;流式检测显示CD14、CD34和CD45表达阴性,CD29、CD44和CD90表达阳性;成骨诱导茜素红染色可见明显的钙结节,成脂诱导油红O染色可见大量脂肪细胞;细胞生长曲线、贴壁率及克隆形成率的结果表明第1代和第3代细胞的活力优于第5代细胞。结果说明密度梯度离心联合贴壁筛选的方法能够有效的分离纯化骨髓间充质干细胞,并能较好的保持其生物功能,在扩增传代过程中,细胞活力会有不同程度的下降。

人表皮干细胞的分离和鉴定

目的 探索一种分离人表皮干细胞的新途径 ,为组织工程皮肤的构建提供种子细胞。方法 以基底细胞作常规细胞培养 ;采用分类技术并结合表皮干细胞的特性 ;免疫细胞化学S P法鉴定。结果 用中性蛋白酶和胰酶消化可分离基底细胞 ,(1～2 )× 10 4/ml的基底细胞接种于以 3T3为滋养层的培养瓶内 ,以含EGF等因子的DMEM为培养液 ,2d后细胞开始增殖 ,一周许去除滋养层 ,10～ 12d可传代。异硫氰酸酯荧光素 (FITC)标记的基底细胞经流式细胞仪分选及IV型胶原 2 0min内的粘附后获得一些圆形、大小较一致的细胞。以鼠抗人K19的单抗为一抗 ,免疫细胞化学S P法呈棕黄色阳性反应 ,证实分离出的细胞为表皮干细胞。结论 通过荧光激活细胞分类和IV型胶原的粘附可分离出表皮干细胞 。

表皮干细胞的快速高效分离

目的寻找一种快递高效分离组织工程化皮肤种子细胞-皮肤干细胞的方法。方法取成人手术切除之包皮,利用I型胶原酶结合胰蛋白酶消化法,快速分离表皮干细胞,并对其进行鉴定及相关的生物学特性的研究。结果应用I型胶原酶结合胰蛋白酶,可在3小时内快速分离到表皮干细胞及成纤维细胞,经流式细胞仪及细胞免疫荧光鉴定,表皮细胞群体中角蛋白19(K19)阳性表达的细胞即表皮干细胞约占18％,但是其体外短期扩增仍较困难。结论利用胶原酶消化法可在短期内高效分离到用于构建组织工程化皮肤的种子细胞,这为快速构建组织工程化皮肤提供了可能。

人表皮干细胞的体外分离培养和鉴定

目的:探讨人表皮干细胞的体外快速分离培养及鉴定方法。方法:中性蛋白酶和胰蛋白酶两步法从手术切除的人包皮组织中分离表皮层和真皮层,并获得表皮单细胞悬液,采用Ⅳ型胶原铺板选择性粘附、分离和角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)培养表皮干细胞。倒置显微镜下观察培养细胞的生长状况,检测细胞克隆形成率,免疫组化染色观察表皮干细胞标志物β1整合素和角蛋白19(K19)的表达;以角质形成细胞作为对照。结果:组织学观察显示,培养24h后细胞呈克隆状生长;所分离、培养细胞的克隆形成率高于对照角质形成细胞组;免疫组化染色显示,培养细胞β1整合素及Kl9均呈阳性表达。结论:运用Ⅳ型胶原粘附结合K-SFM培养可以实现人表皮干细胞的体外快速分离和培养。