利用杆状病毒表达系统表达金鱼生长激素I基因

以不含起始密码ＡＴＧ的质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３为转移载体，将编码金鱼生长激素Ｉ的ｃＤＮＡ插入粉纹夜蛾核型多角体病毒（ＴｎＮＰＶ）基因组中，构建了形成多角体的重组病毒株ＴｎＮＰＶＳＸ＋ｇｆＧＨＩ２ｌａ。该毒株能利用合成多角体ＸＩＶ串联启动子，在重组病毒感染的草地贪夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ，Ｓｆ）昆虫细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素Ｉ基因。感染离体细胞及虫体后的蛋白ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳表明，所表达的蛋白分子量为２２５ｋＤａ，与理论计算值相符。Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实。

猪生长激素基因在昆虫细胞中的分泌表达

将PCR扩增得到的 pGH基因插入到带有 polh启动子和 gp6 7强信号肽序列的杆状病毒转移载体pAcGP6 7 A中 ,构建重组质粒 pGP6 7pGH ,并与线性化致死缺失型苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒 (AcMNPV OCC-)基因组DNA共转染Sf9细胞 ,构建出重组病毒AcMNPV pGP6 7 pGH OCC-。感染重组病毒的Hi5细胞的表达产物的SDS PAGE和Westernblot结果表明 ,细胞可溶蛋白和培养液上清中均有一条分子量约为 2 2kDa的猪生长激素特异性反应带 ,且培养液上清中的目的蛋白分子量比天然pGH略大一些。薄层扫描仪扫描估测可知 ,重组pGH分别占细胞可溶蛋白的 8 98%和培养液上清总蛋白的 3 6 1%。将表达 96h的培养液上清浓缩液进行N 糖基化分析 ,结果显示重组 pGH无N 糖基化加工修饰。

外源猪生长激素基因在金鱼体内的整合与表达研究

外源猪生长激素基因在金鱼体内的整合与表达研究张志红刘桂生张玉廉陈清轩（中国科学院发育生物学研究所北京１０００８０）自１９８２年Ｐａｌｍｉｔｅｒ［１］等人给小鼠受精卵雄原核注射大鼠生长激素基因培养成功“超级”鼠以来，由于人们认识到转基因技术导致动植物品...

杆状病毒重组蛋白金鱼生长激素Ⅰ的纯化

利用放射免疫分析（ＲＩＡ）证实了含金鱼生长激素ⅠｃＤＮＡ的重组病毒在感染细胞９６ｈ后所表达的生长激素达到最高水平，平均每１０５个细胞可分泌金鱼生长激素Ⅰ最高达２８８０７ｎｇ；平均每克干虫可产生金鱼生长激素Ⅰ９２５３μｇ。从感染重组病毒的无血清细胞培养基中纯化生长激素Ⅰ，平均每毫升培养基可纯化具免疫活性纯度９５％以上的金鱼生长激素Ⅰ达６６４２２４ｎｇ。纯化后蛋白的Ｎ末端首２０个氨基酸序列测定的结果表明其信号肽得到了准确的切割。从而保障了表达蛋白的生物活性。

猪生长激素基因在杆状病毒载体系统中的表达

通过对猪生长激素 (pGH)基因的cDNA进行测序 ,得到 pGHcDNA的全序列 ,并与Seeburg等报道的序列进行了比较和讨论。然后利用具人工合成启动子和多角体蛋白XIV启动子的转移载体质粒 pSXIVVI+ X3/ 4构建出含 pGH基因的重组质粒 pX3/ 4 pGH。将 pX3/ 4 pGH与致死缺失型线性化AcMNPV OCC- DNA共转染Sf9细胞 ,构建出既能形成多角体又能表达 pGH基因的苜蓿丫纹夜蛾核多角体重组病毒AcMNPV pX3/ 4 pGH OCC+ 。感染重组毒株的Hi 5细胞可溶蛋白及其培养上清的SDS PAGE和Westernblot的分析结果表明 ,感染细胞的蛋白电泳带的 2 0 .7kDa处有一条猪生长激素特异带 ,但培养上清中没有。凝胶黑度扫描估测结果显示 pGH蛋白占细胞可溶蛋白的 4 .4 8%。

分泌型重组人生长激素工程菌发酵及其产物纯化

在 5L发酵罐中将工程菌pET ompA3 hGH BL2 1 (DE3)进行补料式发酵 ,诱导表达分泌型重组人生长激素。通过对发酵培养基成分、补料成分、补料体积、补料时机和滴加流速的选择 ,分泌表达rhGH的量可达到 2 5 0mg L ,占周质蛋白的 44%～ 5 4 % ,发酵周期缩短为 8h。用rhGH纯蛋白免疫动物制备的多克隆抗体制成的抗体亲和层析柱 ,一步纯化大肠杆菌周质中分泌表达的rhGH ,产物纯度达到 96%以上 ,纯化产物在分子质量大小。

GDF9对绵羊卵丘细胞增殖的影响

本试验旨在探究生长分化因子9(GDF9)对卵丘细胞扩展相关基因和激素受体基因表达量及激素分泌的影响,为GDF9在绵羊卵泡发育中的作用提供依据。以绵羊卵丘细胞为研究对象,通过在低血清细胞培养液中添加不同浓度(0、50、100、200、400 ng/mL)的GDF9,培养绵羊卵丘细胞48 h后,提取细胞总RNA,利用实时荧光定量PCR技术,以β-actin为内参基因,检测卵丘细胞扩展相关基因透明质酸合酶2(HAS2)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、穿透素3(PTX3)及激素受体相关基因卵泡刺激素受体(FSHR)、促黄体生成素受体(LHR)和雌激素受体(E2R)的mRNA相对表达量;利用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养液中卵丘细胞分泌的雌二醇(E2)和孕酮(P4)含量。结果显示:在细胞培养液中添加200 ng/mL GDF9时,HAS2、PTX3、FSHR、E2R和LHR的mRNA相对表达量极显著高于对照组与其他处理组(P<0.01);PTGS2 mRNA相对表达量极显著高于对照组、50和400 ng/mL GDF9组(P<0.01),显著高于100 ng/mL GDF9组(P<0.05)。当添加400 ng/mL GDF9时,各基因mRNA相对表达量均极显著低于200 ng/mL GDF9组(P<0.01);E2分泌量极显著高于对照组与50 ng/mL GDF9组(P<0.01),显著高于100 ng/mL GDF9组,与200 ng/mL GDF9组差异不显著(P>0.05)。100、200和400 ng/mL GDF9组P4分泌量显著高于对照组(P<0.05),与50 ng/mL GDF9组没有显著差异(P>0.05),且3组之间差异不显著(P>0.05)。综上所述,GDF9能够促进绵羊卵丘细胞扩展,并参与绵羊卵丘细胞激素分泌的调控。

羊生长激素在大肠杆菌中的表达及分泌初探

利用PCR方法,将羊生长激素(oGH)成熟蛋白编码序列扩增,再将扩增产物接入分泌型表达载体pET12a(SalI位点)中,利用宿主菌自身的OmpT信号肽引导羊生长激素在E.coliBL21(DE3)中分泌,获得正向插入重组质粒pET12-oGH8,对重组子及对照菌进行诱导表达,薄层色谱扫描(SDS-PAGE)检测结果发现,oGH在OmpT信号肽引导下未见明显分泌,推测oGH自身的氨基酸序列可能是影响其在E.

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人生长素

人生长素是由腺垂体分泌的一种在人体生长、发育及代谢中发挥重要作用的激素,具有广泛的生理作用。利用家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bac-to-Bac表达系统,将人生长素基因(hgh)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,通过细菌转座子原理,转化BmDH10Bac细胞,获得重组穿梭载体质粒Bacmid-hgh,并将其转染家蚕BmN细胞,获得含有hgh的重组杆状病毒。将此重组病毒感染家蚕BmN细胞,收集重组病毒液并穿刺接种家蚕5龄起蚕,3 d后观察到家蚕感染了杆状病毒的症状,并通过SDS-PAGE和Western blotting方法在家蚕血液中检测到分子质量约20 kD的目的蛋白,表明人生长素通过Bac-to-Bac系统在家蚕体内获得了表达。

金鱼生长素Ⅰ基因的原核表达及其多克隆抗体制备

鱼生长激素(Fish growth hormone,fGH)是鱼类脑垂体中分泌的促进生长的单一亚基的蛋白激素.它参与鱼的生长代谢,能够加速蛋白质合成和脂类降解等生理功能,具有增强食欲、提高饲料转化率的作用.用引入酶切位点BamHⅠ和NotⅠ的引物,以质粒pBluescript SK-gfGHⅠ为模板,PCR扩增获得了gfGHⅠ编码区序列,分别定向插入原核表达载体pET-28a中,构建了原核表达载体pET28a-gfGHⅠ,pET28a-gfGHⅠ转化大肠杆菌BL21(DE3),在1.0 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导下,表达出融合蛋白(His)6 tag-gfGHⅠ,该蛋白分子量大约为26 ku;经MALDI-TOF-MS以及抗HIS抗体的Western blotting鉴定,该融合蛋白即为表达的目的蛋白;经超声破碎鉴定该蛋白为包涵体形式存在,用连续超声破碎的方法,回收该蛋白纯度可达85.1%,免疫小鼠,间接ELISA法检测抗体效价为1∶1 600.该抗体的获得为gf-GHⅠ基因在酵母和水稻中的异源表达及功能鉴定奠定了基础.

狐狸生长激素基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

为制备重组狐狸生长激素(fGH),采用RT-PCR方法,从银狐垂体中扩增fGHcDNA基因,利用SnaBI和NotI位点将fGH基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9K中α-因子信号肽的下游,构建成fGH基因的酵母分泌型表达载体pPIC9K/fGH,载体经SalI酶切线性化后,通过电转移将线性化的pPIC9K/fGH转化到组氨酸缺陷型酵母宿主菌GS115中。然后利用不含氨基酸的以葡萄糖为碳源的培养基(MD)和以甲醇为碳源的培养基(MM)筛选出组氨酸His+型和甲醇利用正型(Mut+)酵母重组体,再经G418加压筛选出高拷贝fGH基因的重组酵母,经摇瓶发酵培养和甲醇诱导使fGH进行分泌表达。结果表明本实验扩增的fGH基因序列与GenBank发表的序列基本一致,发酵液经SDS-PAGE和Western blotting检测证明构建的重组酵母能够分泌表达fGH,表达的fGH占发酵液总蛋白的34%,表达量达119mg/L发酵液。