珍稀药用植物斑叶兰(Goodyera schlechtendaliana)的研究进展

斑叶兰是一种高山地区珍稀药用植物,为了保护和研究这种濒危药用植物,对珍稀药用植物斑叶兰的研究进展进行了综述。着重从生殖生态、资源调查、化学成分分析、分类学与谱系地理学、核糖体DNA内转录间隔区(rDNA ITS)序列克隆与分析、药理作用、新种发现、菌根营养、传粉生物学、遗传多样性分析、指纹图谱、组织培养等方面阐述,并对斑叶兰的研究进行了展望。综述表明斑叶兰用途广泛、药效显著,但药农大肆采掘,且采挖不当,生态遭受破坏,资源日趋枯竭,而斑叶兰自然繁殖极慢,药源紧缺,远不能满足市场需要,因此应该对斑叶兰加大组织培养力度,实现斑叶兰优质种苗的快速繁殖,则可在一定程度上有望解决中药材来源匮乏和缓解野生资源遭受严重破坏的压力,继而可有效地保护好斑叶兰这种珍贵有限的药用植物野生资源,这对发展中国中草药事业具有非常重要的现实意义。

五府山斑叶兰(Goodyera schlechtendaliana)的组织培养

本研究对五府山斑叶兰的组织培养进行了探究。结果表明,选择去根植株作为外植体并采用75%酒精消毒50 s+0.1%氯化汞消毒7 min的消毒方式有利于五府山斑叶兰无菌体系的建立;与初代培养基A(MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)相比,初代培养基B (MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L)可显著促使五府山斑叶兰带芽茎段和去根植株出芽;对于五府山斑叶兰的芽增殖,在0.1 mg/L NAA的条件下,添加1 mg/L KT和2 mg/L KT,两者的芽增殖无显著差异,但在0.1 mg/L NAA的条件下,添加1 mg/L 6-BA和2 mg/L 6-BA,两者的芽增殖则有显著差异,MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.1 mg/L比较适合斑叶兰的芽增殖;对于五府山斑叶兰的单芽生根,添加一定浓度的NAA的1/2MS,均可促进其生根,但NAA浓度超过0.5 mg/L则生根量减少,培养基1/2MS+NAA 0.3~0.5 mg/L比较适合五府山斑叶兰单芽的生根;五府山斑叶兰试管苗移栽驯化的较佳处理方式是:MS+0.6 mg/L PP333每天早晚浇灌1次。本试验结果可为五府山斑叶兰种苗规模化繁育提供一定的技术基础。

不同产地斑叶兰及近缘种植物中两种内酯苷类成分的含量测定

比较不同产地斑叶兰Goodyeraschlechtendaliana及近缘种植物中两种内酯苷类成分的含量,为斑叶兰药材的质量控制提供参考。采用HPLC-ELSD法,以ChromCore AQ C18(3μm,4.6 mm×250 mm)为色谱柱,超纯水为流动相,等度洗脱;流速0.5 mL·min^(-1),柱温30℃,蒸发光散射检测器雾化温度70℃;载气流速2.5 mL·min^(-1),进样量5μL,测定30批不同产地斑叶兰及近缘种内酯苷类成分含量。结果表明,斑叶兰苷和金线莲苷含量的线性范围均为62.5~1500μg·mL^(-1),相关系数r分别为0.9995、0.9996,精密度、重复性、稳定性的RSD均小于3%;平均加样回收率分别为101.41%和101.16%,RSD分别为1.53%和1.36%。30批斑叶兰及近缘种植物的斑叶兰苷含量在28.31~243.07 mg·g^(-1)之间,平均含量为134.31 mg·g^(-1),存在较大的差异(RSD=38.40%);30批斑叶兰及近缘种植物的金线莲苷含量在0~184.37 mg·g^(-1)之间,平均含量为34.50 mg·g^(-1),也存在较大的差异(RSD=141.30%)。该方法操作简便、快捷、稳定性和重复性良好,具有较好的精密度和准确度,可用于斑叶兰及近缘种内酯苷类成分含量分析。

不同来源斑叶兰中金线莲苷含量研究

以金线莲为对照,采集贵州松桃、湖南永顺、重庆秀山、贵州遵义、浙江建德5种不同来源的斑叶兰,经6个月高山林下仿野生栽培,研究了斑叶兰和金线莲的金线莲苷含量。结果表明,5种来源斑叶兰金线莲苷含量组间差异极显著,且均显著低于金线莲。其中:来自湖南永顺的斑叶兰中金线莲苷含量最低,显著低于其他4个来源的斑叶兰;其余来源斑叶兰中金线莲苷含量差异不显著。

斑叶兰的组织培养及快速繁殖技术研究

应用组织培养及快速繁殖技术对斑叶兰(Goodyera schlechtendaliana Rchh.f.)芽的诱导和丛生芽的增殖复壮进行研究。研究发现,随着6-BA浓度的提高,斑叶兰芽增殖率上升,以6-BA 4.0 mg/L处理的增殖率最高;添加6-BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L可将斑叶兰增殖控制在丛生芽阶段;添加100.0 g/L椰汁和0.5 g/L活性炭有利于提高斑叶兰增殖率与丛生芽的生长势,降低褐化;添加IBA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.5 g/L的1/2 MS基本培养基有助于斑叶兰生根且根系生长健壮。

斑叶兰自然种群生物量生殖分配研究

斑叶兰开花前各构件的生物量在总生物量中所占比例具有明显差异，且在生境间具显著差异。在柳杉林中，茎构件所占比例显著高于其它构件的比例；其它生境中正常叶的比例显著高于同生境下其它构件的比例。花期，斑叶兰茎和叶构件所占比例最大，其中仅在灌丛中正常叶构件分配比例略大于其茎构件的，但二者差异不显著；生殖构件中，花瓣所占比例最大；除花托叶（p=0．002）外，其余生殖构件的分配比例在生境之间的差异均不显著；合蕊柱在各群落生境中的分配比例差异极小，几乎是恒定的。斑叶兰的生物量生殖分配表现出随分布群落演替阶段的提高而下降的趋势，即竹林〉人工柳杉林〉灌丛〉混交林；其生殖分配在20．35％～28．90％之间，而以干重计算则为21．09％～31．80％之间，明显高于其它一些多年生植物的（0％～20％），而表现出一年生植物的生殖分配特性。

斑叶兰化学成分研究

目的：研究斑叶兰的化学成分。方法：采用多种色谱方法进行分离纯化,通过波谱数据及核对文献鉴定化合物结构。结果：从斑叶兰95%乙醇提取物中分离得到7个化合物,分别鉴定为：丁香醛（Ⅰ）、5-羟甲基糠醛（Ⅱ）、别欧前胡素（Ⅲ）、香草酸（Ⅳ）、阿魏酸（Ⅴ）、单棕榈酸甘油（Ⅵ）和β-谷甾醇（Ⅶ）。结论：其中,化合物Ⅱ～Ⅶ为首次从该属植物中分离得到,化合物Ⅰ～Ⅶ均为首次从该植物中分离得到。

斑叶兰抗氧化活性组分研究及其乳膏的制备

目的:评价"药食同源"中草药斑叶兰的各不同萃取部位对体外自由基的清除即抗氧化作用,并富集抗氧化活性组分从而制备乳膏制剂。方法:采用体外清除DPPH自由基的方法确定抗氧化活性最强的部位,通过HPLC外标法测定阿魏酸和香草酸是乙酸乙酯部位的主要成分,二者总含量占该部位的76.17%。以硅胶、凝胶柱层析法富集活性部位,并优化提取工艺和基质处方。结果:斑叶兰的乙酸乙酯部位清除自由基能力最为突出,在0.5 g·L^(-1)时达到92.31%,仅次于阿魏酸,IC_(50)分别为0.1622、0.1490 g·L^(-1)。结论:为将其研究开发成为天然中药美容护肤品奠定了基础,也为其开发为抗氧化药物用于治疗各种疾病提供了理论依据。

斑叶兰化学成分的分离鉴定

目的:对斑叶兰属植物斑叶兰Goodyera schlechtendaliana的化学成分进行分离纯化,从而丰富斑叶兰的化学成分,为斑叶兰后续深入研究奠定基础。方法:取斑叶兰干燥全草10 kg,85℃下用95%乙醇回流提取4次,合并提取液,减压浓缩得到粗浸膏,再将粗浸膏混悬于蒸馏水中,依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取,得到石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位。采用硅胶,Sephadex LH-20,ODS等多种色谱填料和半制备高效液相对斑叶兰的乙酸乙酯和正丁醇萃取部位进行分离和纯化,利用1H-NMR,13C-NMR,MS等各种现代波谱技术以及化合物的理化性质并结合参考文献确定化合物的化学结构。结果:从斑叶兰乙酸乙酯部位和正丁醇部位分离得到10个化合物,分别是2,5-二羟基-4-甲氧基-9,10-二氢菲(1),间苯三酚三甲醚(2),3,4-二羟基苯甲酸(3),4-羟基苯甲醛(4),4-羟基苯甲酸(5),槲皮素(6),香兰素(7),胡萝卜苷(8),腺嘌呤(9),腺嘌呤核苷(10)。结论:化合物1~10均为首次从斑叶兰属植物中分离得到。