基因1型鹅星状病毒VP27蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备可特异性识别基因1型鹅星状病毒(Goose astrovirus genotype 1,GAstV-1)且与GAstV-2不发生交叉反应的多克隆抗体,以期为后续GAstV-1免疫检测技术的建立提供材料。【方法】通过比对GAstV-1与GAstV-2衣壳蛋白的氨基酸序列以寻找其差异较大的区域作为靶基因。对GAstV-1 GDYJ-21-01株VP27基因密码子进行偏嗜性优化合成,构建原核表达质粒pCZN1-GAstV-1 VP27,转化大肠杆菌Top10感受态细胞以诱导表达VP27蛋白;将纯化后的VP27蛋白免疫新西兰白兔后收获抗血清以制备GAstV-1 VP27多克隆抗体,通过间接ELISA和SDS-PAGE分析该纯化抗体的效价和纯度,并利用间接免疫荧光试验(IFA)检测多克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建重组质粒pCZN1-GAstV-1 VP27;SDS-PAGE显示其表达的重组蛋白分子质量约为35 ku,主要以包涵体形式存在。间接ELISA试验结果显示,纯化后的GAstV-1 VP27多克隆抗体效价高达1∶9 841 500,纯度高于85%。IFA结果显示,GAstV-1 VP27多克隆抗体可特异性识别GAstV-1,且与GAstV-2无交叉反应。临床病料组织检测结果显示,GAstV-1核酸阳性的病料组织均可出现特异性荧光,而GAstV-2核酸阳性且GAstV-1核酸阴性的病料组织未出现荧光。【结论】本研究获得了高效价且可特异性识别GAstV-1(与GAstV-2无交叉反应)的VP27多克隆抗体,为建立鉴别诊断GAstV-1的抗原免疫检测技术奠定了基础。

1型鹅星状病毒ORF2蛋白原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

【目的】利用原核表达系统表达1型鹅星状病毒(Goose astrovirus 1,GAstV-1)结构蛋白ORF2,并制备其多克隆抗体。【方法】根据GAstV-1 TZ03株基因序列,对ORF2基因序列进行大肠杆菌密码子偏爱性优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组质粒pET-ORF2,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达重组蛋白,通过SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白;将鉴定正确的重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,以间接免疫荧光试验鉴定多克隆抗体的特异性。【结果】酶切和测序结果显示,成功获得重组质粒pET-ORF2;SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白分子质量约为70 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果表明,该蛋白能与抗His标签鼠单克隆抗体发生特异性反应。间接ELISA检测制备的兔抗ORF2蛋白多克隆抗体效价达1∶128000;间接免疫荧光试验结果显示,制备的多克隆抗体能与GAstV-1发生特异性反应。【结论】原核表达的GAstV-1 ORF2重组蛋白具有良好的免疫原性,制备的兔源多克隆抗体具有较高的效价和特异性,为研制GAstV-1相关诊断试剂奠定了基础。

小鹅瘟病毒、鹅星状病毒Ⅰ型与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断及病原分析

【目的】2023年4月,河南新乡某地鹅场雏鹅群急性发病,死亡率高达25%,为确定引起该鹅场雏鹅发病的病因,本研究对送检的病死雏鹅进行剖检和实验室诊断。【方法】无菌采集病死雏鹅肝脏、脾脏、肾脏和小肠等组织样品及心血和肝脏外层纤维素性渗出物,通过对心血及肝脏外层纤维素性渗出物样品进行细菌分离培养、革兰染色镜检观察、16S rRNA基因及药物敏感性试验鉴定病鹅感染细菌及感染菌株的药物敏感性情况;通过PCR/RT-PCR方法对其常见雏鹅病毒性传染病病原核酸进行检验,并对阳性病原的主要结构蛋白基因进行测序分析,确定病鹅感染的病毒性病原及其分子流行病学情况。【结果】细菌学试验结果显示,分离菌株在血平板上呈半透明圆形突起、边缘整齐、表面光滑菌落,形态学观察显示,该菌为单个和成对的革兰阴性短杆菌,符合鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的特性。16S rRNA基因扩增测序与BLAST分析进一步证实该菌为RA。药敏试验结果显示,该菌株对头孢曲松和头孢噻肟敏感,对阿莫西林、四环素和多黏菌素B耐药。常见雏鹅病毒性传染病病原核酸PCR/RT-PCR检测发现,该鹅场样品小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV)和鹅星状病毒Ⅰ型(genotypeⅠGoose astrovirus,GAstV-1)核酸呈阳性,GAstV-2、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)和鹅呼肠孤病毒(Goose reovirus,GRV)核酸阴性,将致病毒株分别命名为GPV/HN-2023和GAstV-1/HN-2023。进一步对GPV/HN-2023和GAstV-1/HN-2023的主要结构蛋白基因分析发现,GPV/HN-2023与DY-16株的亲缘关系较近,属于DY-16-like毒株,且VP3蛋白存在2个特有的氨基酸位点突变D248E和V314L;GAstV-1/HN-2023与GAstV-1毒株亲缘关系较近,属于GAstV-1分支,ORF2蛋白存在3个特有的氨基酸位点突变G47R、S207G和A628T。【结论】本研究通过综合诊断方法明确了GPV、GAstV-1与RA混合感染是引起该鹅场雏鹅发病的病因,分析了致病菌RA的耐药性和病毒性致病原GPV和GAstV-1的遗传演化及变异特点,为河南地区雏鹅疫病的科学防控提供理论参考。