HLA-DRB1^(*)11:01与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系探讨

目的我们前期研究显示,无论在汉族人群还是黎族人群中,HLA-DRB1^(*)11∶01均是与机体自发清除HCV相关联的HLA-Ⅱ类基因,因此,本研究的目的是探讨HLA-DRB1^(*)11∶01基因与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系。方法对广东地区常见的HCV 6a慢性感染者HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组和阴性组的E1E2和NS3基因进行病毒选择压力以及病毒群体扩张的分析。采用覆盖我国常见HCV基因型保守区的CD4+T细胞表位的重叠肽段刺激HCV自发清除组和慢性感染组,通过ELISPT实验,根据每孔的斑点形成细胞数以及在不同组出现的频次评估HLA-DRB1^(*)11∶01基因与CD4+T细胞表位的关系。结果广东地区常见的HCV 6a感染者HLA-DRB1^(*)11∶01阴性组E1E2和NS3的阳性选择位点以及位于CD4+T细胞表位的位点数均大于HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组;两组HCV 6a感染者在广东地区均具有群体扩张趋势,且HLA-DRB1^(*)11∶01阴性组的扩张趋势明显高于HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组。HCV自发清除组对其中5条肽段(C-52 E2691-707、C-119 NS31545-1560、C-134 NS4A1669-1684、C-154 NS4B1912-1927和C-159 NS4B1929-1944)刺激的应答率较高,HCV慢性感染组对其中的2条肽段(C-111 NS31497-1512和C-130 NS31650-1665)刺激的应答率较高。当考虑HLA-DRB1^(*)11∶01分型时,在慢性感染组和自发清除组HLA-DRB1^(*)11∶01阳性和HLA-DRB1^(*)11∶01阴性PBMCs产生的HCV特异性免疫应答均无统计学差异。结论研究揭示了HLA-Ⅱ类基因HLA-DRB1^(*)11∶01与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系,同时,获得HCV泛基因型CD4+T细胞抗原候选表位,为研发适合HCV泛基因型的T细胞疫苗提供基础数据。

间充质干细胞通过诱导髓系来源CD11b^+Gr1^+细胞的抑制功能促进小鼠乳腺癌进展

目的探讨间充质干细胞(MSC)诱导骨髓来源的CD11b+Gr1+细胞免疫抑制功能对肿瘤的影响。方法将骨髓中CD11b+Gr1+细胞与MSC共培养后,通过流式细胞术测定CD11b+Gr1+细胞免疫表型,通过T细胞抑制性实验分析T细胞活化情况,采用小鼠4T1乳腺癌模型观察MSC通过CD11b+Gr1+细胞对肿瘤生长的影响。结果 MSC能够促进骨髓中CD11b+Gr1+细胞的存活和生成,同时可诱导正常小鼠骨髓中CD11b+Gr1+细胞对T细胞的抑制作用。动物实验结果显示,MSC处理后的骨髓CD11b+Gr1+细胞可以促进肿瘤的生长,加速小鼠的死亡。结论 MSC可以通过促进骨髓来源的CD11b+Gr1+细胞的抑制作用加速肿瘤的生长进程。

小鼠缺血性脑卒中后病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞种类以及基因表达谱分析

目的探讨小鼠缺血性脑卒中发生后不同时间点病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞浸润情况以及基因表达的动态变化。方法将60只6~8周龄成年雄性C57鼠采用随机数字表法分为6组:假手术组(Sham组)和缺血性脑卒中后第1天(D1L组)、第3天组(D3L组)、第7天组(D7L组)、第14天组(D14L组)和第21天组(D21L组)。Sham组小鼠给予缺血性脑卒中处理但不进行大脑中动脉结扎,缺血性脑卒中各组小鼠给予缺血性脑卒中手术处理。按上述时间点取病灶组织消化后,流式细胞术分选CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞,然后应用RNA-seq技术,对小鼠不同时间点分选的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞进行基因表达谱测序、生物信息学分析以及细胞种类验证。结果在缺血性脑卒中发生后,γδT淋巴细胞和天然杀伤性T淋巴细胞的数目逐渐上升,在D3达到高峰,然后逐渐下降趋于稳定;CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞数目逐渐上升,在D14达到高峰;调节性T淋巴细胞数目在D14出现明显的上升。结论缺血性脑卒中发生后不同时间点,不同种类的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞从外周循环系统浸润到病灶组织,早期主要以发挥先天免疫功能的CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞为主,中晚期主要以发挥适应性免疫的CD4 T淋巴细胞和CD8 T淋巴细胞为主。本研究首次运用转录组测序技术和流式细胞术系统阐述了缺血性脑卒中后不同时间点病灶部位CD45^(+)CD11b^(-)免疫细胞的浸润情况以及基因表达特点,为研究缺血性卒中发生、发展的分子机制提供基础。

C57BL/6小鼠外周淋巴组织和肝脏中CD11c^(+)B220^(+)NK细胞分析

目的研究CD11c^(+)B220^(+)自然杀伤(NK)细胞在外周淋巴组织和肝脏中的分布及其表面浆细胞样树突状细胞抗原1(PDCA-1)分子的表达情况。方法采集C57BL/6小鼠脾脏、淋巴结和肝脏组织,制备单个核细胞悬液,通过多色流式细胞术检测3个组织器官中CD11c^(+)B220^(+)NK细胞的比例及其表面PDCA-1分子的表达情况。结果脾脏、淋巴结和肝脏均存在CD11c^(+)B220^(+)NK细胞,在脾脏中比例最高,达到(2.82±0.45)%。3个组织中均有部分CD11c^(+)B220^(+)NK细胞表达PDCA-1,脾脏最明显。结论CD11c^(+)B220^(+)NK细胞是小鼠外周淋巴组织和肝脏中NK细胞的重要亚群,因组织不同其表面PDCA-1表达存在差异。

参附注射液抑制HMGB1诱发的CD11b^+细胞麻痹对严重脓毒症内皮的保护作用

目的探讨严重脓毒症幼猪生化指标、肺部病理损伤与免疫机制间的相互关系,以及参附注射液的干预作用。方法将2~3月龄巴拿马香猪按随机数字表法分为假手术组(Sham组;静脉注射生理盐水)、脂多糖(LPS)致严重脓毒症模型组(LPS组;静脉注射LPS 1 mg/kg,0.5 mg·kg^-1·h^-1维持12 h)、参附注射液干预组(SF组;制模同时静脉注射参附注射液10 mL/kg,每日2次),每组5只。制模后48 h取血检测C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)、氧合指数(PaO2/FiO2)、剩余碱(BE)、血乳酸(Lac)等生化指标;取外周血行流式细胞检测,分析中性粒细胞数目〔髓过氧化物酶阳性(MPO^+)〕及其激活亚群CD11b^+CD64^+、M1型巨噬细胞(CD80^+CD64^+)、CD4^+和CD8^+T细胞的变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血浆细胞因子水平;苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理损伤;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺组织损伤相关分子及其受体、趋化因子、炎性因子、血管内皮相关分子、紧密连接蛋白的mRNA表达。结果与Sham组比较,LPS组CRP、PCT、Lac水平明显升高,PaO2/FiO2、BE明显下降;外周血CD80^+CD64^+、CD11b^+CD64^+、MPO^+、CD4^+和CD8^+T细胞数、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平明显降低,白细胞介素-10(IL-10)、内皮细胞生长因子(VEGF)水平明显升高;肺组织高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、促血管生成素2/1(Ang2/Ang1)的mRNA表达均明显升高,Toll样受体9(TLR9)、趋化因子(CXCL9、CXCL10)、TNF-α、IL-27、内皮细胞TEK酪氨酸激酶2(TIE2)、紧密连接蛋白血管内皮-钙黏蛋白(VE-CAD)和封闭蛋白(Occludin)的mRNA表达均明显下降;HE染色显示,肺泡腔炎性细胞浸润渗出、肺泡实变及肺泡间质层明显增厚、肺气肿。与LPS组比较,SF组Lac明显下降(mmol/L:4.2±1.0比6.3±1.1,P<0.05),BE、PaO2/FiO2明显升高〔BE(mmol/L):-6.4±2.6比-11.6±2.5,PaO2/FiO2(mmHg,1 mmHg=0.133 kPa):180±36比105±35,均P<0.05〕,CD80^+CD64^+、CD11b^+CD64^+、MPO+细胞比例均明显上升〔CD80^+CD64^+:(7.13±2.01)%比(3.80±0.46)%,CD11b^+CD64^+:(8.33±2.55)%比(2.15±0.47)%,MPO+:(21.22±2.33)%比(8.31±0.46)%,均P<0.05〕;肺组织HMGB1、RAGE的mRNA表达有一定程度下降〔HMGB1 mRNA(2^-ΔΔCT):1.81±0.45比2.23±0.85,RAGE mRNA(2^-ΔΔCT):6.69±3.48比11.60±6.91,均P<0.05〕,CXCL9和TIE2的mRNA表达有一定程度上升〔CXCL9 mRNA(2^-ΔΔCT):1.06±0.63比0.50±0.12,TIE2 mRNA(2^-ΔΔCT):1.42±0.68比0.27±0.16,均P<0.05〕;肺组织病理改变明显减轻。结论BE、Lac、PaO2/FiO2的加重,免疫耗竭、麻痹和无能,可能是导致严重脓毒症幼猪肺脏致死性损伤的重要因素,该损伤可能与HMGB1及其受体RAGE过度活化,TLR9和相应趋化因子及炎性因子受到抑制,导致血管内皮细胞损伤加重和紧密连接蛋白表达减少的毛细血管渗漏机制相关。参附注射液改善严重肺炎并脓毒症的免疫紊乱可能与上调外周血M1型巨噬细胞和激活中性粒细胞、抑制HMGB1及其受体RAGE表达、上调CXCL9和TIE2表达有关。

ICAM-1、MMP-9及NF-κB在胆管癌中的表达及与外周血免疫抑制细胞的关系

目的探讨细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及NF-κB在胆管癌中的表达及外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)髓源性抑制细胞(MDSC)的关系。方法选取昆明医科大学附属甘美医院2017年12月至2019年12月收治的胆管癌患者60例研究对象。采用免疫组化法测定胆管癌组织与癌旁正常组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白;采用流式细胞术检测患者外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DRMDSC比例。比较胆管癌组织与癌旁组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达;不同病理特征ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达及外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例;ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达与外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例相关性。结果胆管癌组织ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白和NF-κB蛋白表达阳性率均高于癌旁正常组(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移ICAM-1蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);III~IV期ICAM-1蛋白表达阳性率高于I~II期(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和临床分期MMP-9蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);淋巴结转移MMP-9蛋白表达阳性率高于无淋巴结转移(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移NF-κB蛋白表达比较无明显差异(P>0.05);III~IV期NF-κB蛋白表达阳性率高于I~II期(P<0.05)。不同性别、年龄、病理分级和淋巴结转移CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例比较无明显差异(P>0.05);III~IV期CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例高于I~II期(P<0.05)。ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例呈线性正相关。结论ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表在胆管癌中高表达,外周血中CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例升高,且ICAM-1蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB蛋白表达与CD14^(+)CD11b^(+)HAL-DR^(-)MDSC比例呈线性正相关。

Lewis肺癌荷瘤小鼠CD4^+CD25^+Foxp3^+调节性T细胞及髓样抑制细胞与肿瘤生长的关系

为研究Lewis肺癌荷瘤鼠CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞和Gr1+CD11b+髓样抑制细胞(Gr1+CD11b+MDSC)比例变化特点,探讨其在诱导肿瘤免疫耐受中的作用,建立了Lewis肺癌模型,观测肿瘤体积变化,绘制肿瘤体积变化曲线;采用流式细胞技术分别于模型建立第0、14、21天检测脾脏、肿瘤引流淋巴结两种细胞比例;荧光定量RT-PCR检测荷瘤小鼠肺组织Foxp3 mRNA的表达。结果表明,随着肿瘤的进行性生长,脾脏及肿瘤引流淋巴结CD4+CD25+Foxp3+Treg、Gr1+CD11b+MDSC比例均明显升高,其中以脾脏的变化最为显著。在荷瘤第21天时,脾脏中两者比例分别为16.97%±1.86%,28.64%±2.32%,与正常对照组比较具有显著的意义。而在肿瘤引流淋巴结中两者细胞的比例分别为18.84%±3.48(P<0.01),3.46%±0.56(P<0.01)。同时RT-PCR结果显示,Foxp3 mRNA在荷瘤鼠肺转移灶组织明显高于正常对照组(P<0.01);结论:CD4+CD25+Treg与Gr1+CD11b+MDSC诱导的肿瘤免疫抑制与肿瘤生长及转移密切相关。