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人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达
被引量:
6
1
作者
徐钰
孙钧铭
+5 位作者
张莲芬
窦文芳
李洁
朱威
朱书峰
金坚
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2008年第2期109-114,共6页
制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 ...
制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽。插入表达载体pPIC9K中α交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF。电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础。
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关键词
人粒细胞集落刺激因子
人血清白蛋白
融合蛋白
毕赤酵母
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职称材料
重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析
被引量:
3
2
作者
黄甜甜
齐剑英
+1 位作者
杨刚刚
叶贤龙
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期3419-3432,共14页
人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)_(3)将hFGF21的N...
人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)_(3)将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体,并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中。通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株,并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率。培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的rHSA-hFGF21蛋白。与hFGF21相比,rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,其血浆半衰期也延长了约27.6倍;中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21;在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果。本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础。
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关键词
成纤维细胞生长因子21(FGF21)
人血白蛋白(HSA)
融合蛋白
毕赤酵母
糖尿病
原文传递
题名
人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达
被引量:
6
1
作者
徐钰
孙钧铭
张莲芬
窦文芳
李洁
朱威
朱书峰
金坚
机构
江南大学生物工程学院生物制药系工业生物技术教育部重点实验室
无锡第三人民医院中心实验室
出处
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2008年第2期109-114,共6页
基金
国家"863"计划项目(2006AA02Z153)
上海市科委生物医药重大科技攻关项目(06DZ19020)
2006江苏省卫生厅科研项目(Z200611)
文摘
制备人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)与人血清白蛋白(HSA)的融合蛋白。从新鲜人外周血中分离单核细胞,给予大肠杆菌脂多糖刺激后,RT-PCR制备G-CSF cDNA,以其为模板扩增得到人G-CSF的编码区序列(525 bp)。重叠PCR拼接HSA-GCSF融合基因(2277 bp),序列测定正确,中间未加入任何连接肽。插入表达载体pPIC9K中α交配因子的开放阅读框内,构建分泌型表达重组质粒pPIC9K-HSA-GCSF。电击转化毕赤酵母菌KM71,G418筛选得到高拷贝转化子。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的相对分子质量约为84 k,Western blot分析融合蛋白为G-CSF与HSA的杂合分子,NFS-60细胞/MTT比色法测定融合蛋白具有G-CSF的生物学活性。结果:构建了可分泌表达HSA-GCSF融合蛋白的毕赤酵母工程菌,为进一步对其进行药学研究奠定了基础。
关键词
人粒细胞集落刺激因子
人血清白蛋白
融合蛋白
毕赤酵母
Keywords
granulocyte colony-stimulating factor
,
human serum albumin
,
fusion protein
,
pichia pastoris
分类号
S642.5 [农业科学—蔬菜学]
Q81 [生物学—生物工程]
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职称材料
题名
重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析
被引量:
3
2
作者
黄甜甜
齐剑英
杨刚刚
叶贤龙
机构
河南师范大学生命科学学院
赣江中药创新中心
出处
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022年第9期3419-3432,共14页
基金
江西省自然科学基金(20212BAB206094)
河南省青年托举项目(2021HYTP042)
河南省重点研发与推广专项(科技攻关)(212102310242)。
文摘
人成纤维细胞生长因子21(human fibroblast growth factor 21,hFGF21)已成为改善血糖和脂质代谢的候选药物,但却存在半衰期短和易被体内代谢等缺点,导致靶组织利用率低,限制了其临床应用。本研究通过柔性连接肽(GGGGS)_(3)将hFGF21的N端连接至人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)的C端,经过毕赤酵母密码子优化后,将重组基因片段rHSA-hFGF21连入pPIC9k和pPICZαA两种载体,并转化到X33、GS115和SMD1168三种不同酵母菌株中。通过加压筛选得到高表达的X33-pPIC9K-rHSA-hFGF21工程菌株,并优化摇瓶诱导条件如OD值、甲醇浓度和诱导时间进一步提高rHSA-hFGF21的表达效率。培养上清经中空纤维膜切向流技术粗分离、Blue亲和层析和Q离子交换层析纯化获得纯度约98.18%的rHSA-hFGF21蛋白。与hFGF21相比,rHSA-hFGF21具有更好的热稳定性和抗胰蛋白酶降解的能力,其血浆半衰期也延长了约27.6倍;中高浓度条件下rHSA-hFGF21刺激HepG2细胞摄取葡萄糖的能力优于hFGF21;在2型糖尿病动物中rHSA-hFGF21比hFGF21具有更好的长效降糖效果。本研究将为FGF21蛋白的大规模生产奠定基础。
关键词
成纤维细胞生长因子21(FGF21)
人血白蛋白(HSA)
融合蛋白
毕赤酵母
糖尿病
Keywords
fibroblast growth
factor
21(FGF21)
human
serum
albumin
(HSA)
fusion
protein
pichia
pastoris
diabetes
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
R915 [医药卫生—微生物与生化药学]
原文传递
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
人GCSF-白蛋白融合蛋白的构建及在毕赤酵母中的表达
徐钰
孙钧铭
张莲芬
窦文芳
李洁
朱威
朱书峰
金坚
《药物生物技术》
CAS
CSCD
2008
6
下载PDF
职称材料
2
重组rHSA-hFGF21融合蛋白在毕赤酵母中的表达纯化及活性分析
黄甜甜
齐剑英
杨刚刚
叶贤龙
《生物工程学报》
CAS
CSCD
北大核心
2022
3
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