红地球葡萄GLRaV-3的茎尖培养脱毒及RT-PCR检测

笔者以带GLRaV-3病毒的红地球为试材,研究了6-BA、NAA、IBA、KT不同配组及茎尖大小对茎尖培养的影响,并利用RT-PCR技术对部分红地球组培苗进行了GLRaV-3病毒检测。研究结果表明:红地球葡萄茎尖培养脱毒最佳茎尖初始培养基为:1/2MS+6-BA0.5mg/L+KT0.5mg/L+NAA0.2mg/L,最佳茎尖分化培养基为:B5+KT1.0mg/L+NAA0.2mg/L;茎尖大小与成活率成正比,与脱毒率成反比;运用RT-PCR检测技术进行了脱毒后组培苗的检测,得到了GLRaV-3的特异片段为300bp,获得了28株脱毒苗,平均脱毒率为43%。

PAS-ELISA检测GFLV和GLRaV-3技术的研究

以中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄资源圃的葡萄品种为试材,对葡萄扇叶病毒(GFLV)和葡萄卷叶病毒Ⅲ(GLRaV-3)进行了A蛋白酶联免疫吸附测定(PAS-ELISA)的检测技术的研究。从阴、阳性对照及抗血清或抗体浓度的选择,到不同时期、检测部位对结果的影响,建立了一套完整的ELISA检测GFLV和GLRaV-3程序;通过试验分析,该方法快速,简便,经济且灵敏度高,不失为葡萄病毒检测的一种新方法。通过检测,还了解到GFLV的发病高峰在春季,主要发病部位在上部叶片,而GLRaV-3的发病高峰在秋季,重要发病部位在下部叶片。

三种ELISA方法检测葡萄卷叶病毒(GLRaV)和扇叶病毒(GFLV)的比较

检测是认识一种病害最基本的前提,通过对三种ELISA检测GLRaV和GFLV的比较认为,双抗夹心-ELISA(DAS-ELISA)、间接-ELISA(PTA-ELISA)和A蛋白夹心-ELISA(PAS-ELISA) 都能检测GLRaV和GFLV。DAS-ELISA能缩短检测的时间,然而这项技术具有较高的株系特异性,在检测中可能产生假阴性反应,因此,必要时可用PTA-ELISA和PAS-ELISA对一些关键样品进行复检。

葡萄卷叶病毒RT-PCR检测技术研究

以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA和dsRNA提取方法进行了研究,从中筛选出了提取葡萄总RNA和dsRNA的适合方法。建立了GLRaV RT-PCR的有效体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR主要成分对RT-PCR的影响,确立了GLRaVRT-PCR的优化体系。

葡萄卷叶病毒主要检测技术比较

葡萄卷叶病(GLRaV)是葡萄上的一种重要病毒病害。本文主要阐述了该病的病原、分布及近些年来各种检测技术在该病检测中的应用情况,分析了各种检测技术的优势和不足及如何在该病检测中对各种方法做合理的搭配应用,优势互补,提高效率。

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄病毒病田间自然发病率调查及检测

对宁夏贺兰山东麓8个酿酒葡萄种植地区8个葡萄品种的病毒病田间自然发病情况进行调查,采用RT-PCR方法,检测了40份样品中GLRaV-1~5这5种葡萄卷叶伴随病毒的感染率。结果表明:宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄主要病毒病有葡萄卷叶病、扇叶病和栓皮病,其中葡萄卷叶病尤为严重;不同酿酒葡萄种植区和品种间葡萄卷叶病的感染存在着差异,老葡萄种植区中品种间葡萄卷叶病发病率明显高于新葡萄种植区的品种;"蛇龙珠"和"黑比诺"是感染葡萄卷叶病毒的主要品种,发病率高达85.1%和52.7%;利用5种葡萄卷叶伴随病毒引物进行RT-PCR检测,检出3种病毒类型,且GLRaV-3的检出率最高,为87.5%。

山东省葡萄几种主要病毒病调查及检测研究

对采自山东省不同葡萄园类别的葡萄样品,采用PTA-ELISA法和Dot-ELISA法对葡萄茎痘相关病毒(GRSPaV)进行了检测,采用DAS-ELISA法对葡萄卷叶病的3个毒原(GL-RaV-1-、2-、3)进行了检测。GRSPaV检测结果表明:检测的61个品种518个样品,阳性样品率33.6%,阳性品种率73.8%,其中资源圃样品阳性率32.7%,生产园样品阳性率34.0%。对检测到阳性样品辅以RT-PCR法验证,2对引物均扩增出了预期片段,分别为解旋酶基因340 bp片段、CP基因842 bp片段。GLRaV-1-、2-、3的检测结果表明:鲜食品种3种病原的阳性样品率分别为33.7%、7.1%、62.2%,酿酒品种阳性样品率分别为35.1%、16.2%、54.1%,综合3种病毒的阳性样品率为76.3%,品种感染率87.7%。通过该类研究对推动国内葡萄无毒化生产有重要意义。

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ宁夏分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

用酶联免疫吸附法对宁夏贺兰山东麓地区不同葡萄品种进行卷叶伴随病毒Ⅲ(GLRaVⅢ)的测定,检测率为37.1%,与田间自然发病率调查结果基本一致.设计GLRaVⅢ外壳蛋白(CP)基因序列引物对,进行RT-PCR扩增,获得1.1 kb的特异片段.其中,CP基因长942 bp,推导的编码蛋白含有313个氨基酸.通过对GLRaVⅢCP基因同源性比较,结果表明,GLRaVⅢ宁夏分离物的CP基因与四川分离物SL-10 CP基因的亲缘关系最近,核苷酸和所编码的氨基酸序列同源性分别为98.8%和98.1%;与巴西分离物PET-4和智利分离物C1-817 CP基因亲缘关系较远,核苷酸序列同源性低于95.0%,所编码的氨基酸序列同源性低于97.0%,认为GLRaVⅢ株系间的CP基因存在差异.

山葡萄“双优”脱毒技术与遗传稳定性和生产性能的研究

1991～1998年，采用热处理（变温38～22℃）进行“双优”茎尖扇叶和卷叶病毒脱毒试验，定植茎尖继代（6～7代）脱毒苗建园，对其遗传稳定性和生产性能观察结果表明：1．0～2．0mm的茎尖脱毒率达68．75％，并易分生和继代培养。“双优”组培树与同品种的扦插树相比较，无论在树形、叶形、果实形态、品质（酒质）、抗寒性等均未出现明显变异。脱毒的组培树抗霜霉病，群体无性系生长一致，平均增产30．67％。脱毒的“双优”组培树具有稳定的遗传性状和生产性能。

宁夏玉泉地区葡萄卷叶病田间自然发病调查及检测

摘要: 对宁夏玉泉营地区葡萄圃内的50多个品种和砧木的卷叶病自然发病情况进行调查研究,结果表明:在美洲种群、东亚种群中没有发现卷叶病症状;欧亚种群卷叶病症状的品种比例最高,且程度严重;欧美杂种、欧山杂种均有表现卷叶病的品种,但发病率、严重度低于欧亚种。欧亚种中,以鲜食品种为主的东方品种比以酿酒品种为主的西欧和黑海品种卷叶病发病率低。

宁夏地区葡萄卷叶伴随病毒遗传变异的PCR-SSCP分析

宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病病株率较高,严重影响了酿酒葡萄产业的健康发展,但有关其病原葡萄卷叶伴随病毒(Grapevine leafroll-associated virus,GLRaVs)的遗传变异情况则鲜有报道.利用RT-PCR技术对宁夏酿酒葡萄不同种植区的7个主栽品种的GLRaV-1和GLRaV-3进行分子检测,利用SSCP技术对扩增片段进行遗传变异分析.试验结果共获得8个GLRaV-1和13个GLRaV-3的阳性样本.8个GLRaV-1分离物基于CP基因分析差异明显,可分为3类;13个GLRaV-3分离物基于RdRp基因分析差异明显,可分为3类,而基于CP和HSP70基因分析可分为2类.说明宁夏酿酒葡萄不同种植区、不同品种的GLRaV-1和GLRaV-3种群分子特性存在差异且遗传变异明显.这有助于宁夏地区酿酒葡萄GLRaVs流行学调查和分子诊断分析,为该病害的防控提供理论依据.

葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ外壳蛋白基因的克隆

根据美国报道的葡萄卷叶伴随病毒Ⅲ (GLRaV 3)CP基因序列 ,设计并合成一对引物 ,用IC RT PCR对GLRaV 3进行检测 ,琼脂糖凝胶电泳表明其大小与预计相符。将其CP基因克隆到pGEM 3zf( +)中 ,经双酶切和序列分析表明所克隆的是GLRaV 3CP基因 ,它与美国分离物相应序列同源性为 94 .1%。

葡萄卷叶伴随3型病毒和葡萄A病毒的多重检测及其系统进化分析

葡萄卷叶伴随3型病毒(Grapevine leafroll associated virus-3,GLRaV-3)和葡萄A病毒(Grapevine virus A,GVA)常常复合侵染部分主栽欧美杂交葡萄品种。以半定量RT-PCR与qRT-PCR方法研究了‘希姆劳特’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Himrod’)中不同组织内病毒的相对积累量,结果表明叶脉和韧皮部内的病毒相对积累量显著高于其他组织。以成熟枝条韧皮部组织的cDNA为模板,优化了RT-PCR多重扩增体系,可以同时扩增待测样本中两种病毒的目标基因。从一株复合感染GLRaV-3与GVA的‘藤稔’葡萄(Vitis vinifera L.×V.labrusca L.‘Fujiminori’)中,分别克隆了GLRaV-3外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长序列和GVA部分基因组区域序列,后者包括CP基因的部分序列与病毒RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing,VSR)基因全长序列。病毒核酸同源性分析与系统进化研究表明,不同GLRaV-3分离物的CP高度保守;而‘藤稔’葡萄的GVA分离物包含多种变异株,具有准种病毒的特点。

葡萄卷叶相关病毒13在我国葡萄上的首次报道

我国葡萄品种资源丰富,栽培面积逐年增加。葡萄感染病毒后,便终生带毒,持续危害,造成生长发育迟缓,树势衰退,严重影响葡萄的产量和品质。山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)是我国重要的野生果树资源,其抗病能力较强,是培育抗病、抗寒优良品种的珍贵种质。

双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测葡萄卷叶病毒3

葡萄卷叶病毒3(GLRaV-3)被认为是葡萄卷叶病最重要的致病因子。本研究根据NCBI核酸数据库中葡萄卷叶病毒3复制酶基因序列保守区,设计合成2对上下游引物和1条Taq Man探针,组成2套反应组合。以病毒RNA反转录合成的c DNA为模板,依据2组引物序列和相同的Taq Man探针序列,在荧光PCR特异性、灵敏度、扩增效率对比试验的基础上,建立了双引物一条探针的实时荧光RT-PCR检测GLRaV-3的新方法,病毒RNA检测下限可达4.5 fg/μL。两套组合相互验证,减少非特异性扩增,进一步提高了方法的特异性。