运用SYBR GreenⅠ荧光实时RT-PCR法检测草莓中甲肝病毒

针对甲肝病毒的vp3/vp1壳蛋白区域设计引物,建立SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测甲肝病毒的反应体系。此方法的病毒检测下限达到101TCID50,标准曲线为Ct=-3.052lg(TCID50)+34.57,线形范围101～105TCID50,相关系数0.9961。该方法对甲肝病毒检测特异,与轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒无交叉反应。针对甲肝病毒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.85%～1.71%(n=5)、批间试验CV为0.76%～1.98%(n=3)。运用此方法随机检测45份草莓样品,检测出3份阳性样品。该检测方法灵敏、特异、重复性好,可应用于水果和蔬菜中甲肝病毒的快速检测。

SYBR GreenⅠ染料-实时荧光定量聚合酶链式反应法检测发酵乳中的霉菌和酵母含量

目的建立一种应用SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量聚合酶链式反应法快速检测发酵乳中的霉菌和酵母菌。方法本研究针对霉菌与酵母菌的保守序列设计引物,确定最优反应体系与反应条件。通过熔解曲线以及非目标菌株的检测验证该方法的特异性;通过菌悬液的梯度稀释检测确定该方法的灵敏度;通过菌悬液与发酵乳样品混合后进行检测,确定该方法的检出限,并得到标准曲线。结果该方法能够特异性的检测发酵乳中的霉菌、酵母菌,无交叉反应。该方法检测霉菌、酵母菌的灵敏度均为10^(2) CFU/mL,并且当菌悬液与发酵乳样品混合后,并没有降低该方法的检出限。在10^(2)~10^(6) CFU/mL浓度范围内,菌液浓度的对数值与循环阈值(cyclethreshold,Ct)具有良好的线性关系,可以在市售样品的检测中通过Ct值计算样品中目标菌的含量,更快的判断发酵乳是否被霉菌、酵母菌污染。结论该方法可用于发酵乳中霉菌和酵母菌的快速检测,为发酵乳的食品安全提供了技术保障。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物,筛选最佳引物浓度和退火温度,绘制标准曲线,优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明:最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R^(2))为0.9823。该方法的最低检出限为1×10^(2)copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%~2.59%和0.36%~0.76%,表现出良好的重复性;仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线,具有较好的特异性;与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。

新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立一种快速检测新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的方法,本研究参考GenBank中登录的NDRV S3基因保守序列设计特异性引物,建立了一种检测NDRV的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.9996,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。对番鸭呼肠孤病毒、禽呼肠孤病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭新城疫病毒和禽流感病毒均未检测到荧光信号。对NDRV的最小检出量为29拷贝/μL,比普通PCR敏感性高100倍。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。

猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

猪圆环病毒(PCV)包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)。近些年来,PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染,因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR鉴别检测方法显得尤为必要。本试验通过特异性引物筛选,各项反应条件优化,建立了实时荧光定量PCR鉴别方法。结果表明:PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL。与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。批内及批间变异系数均小于1%。对98份PCV疑似阳性病料检测结果表明,PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%,共感染率为7.1%。该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

SYBR Green Ⅰ法洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系的建立

为了建立洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,本实验采用MJ Research OpticonTM 2型实时荧光定量PCR仪,利用SYBR Green Ⅰ染料法,根据GenBank上其他昆虫β-actin基因的保守序列设计引物,对PCR退火温度、引物浓度、模板浓度等各反应因子进行优化,结合扩增曲线和熔解曲线进行分析。结果显示,在20μL体系下,当2×SYBRR Premix Ex TaqTM为10μL时,引物和cDNA模板的最佳浓度分别为1μmol/L和50ng/μL。最佳PCR反应程序为:94℃预变性30s,44个循环包括94℃变性10s,45℃退火30s,72℃延伸40s,最后加做熔解曲线82℃1s。结果表明,在洋虫不同发育时期β-actin基因表达水平基本稳定,因此β-actin基因可以作为洋虫实时荧光定量RT-PCR的内参基因。本研究成功建立了2-ΔΔCT相对定量法的洋虫β-actin基因实时荧光定量RT-PCR体系,并分析了优化PCR反应体系的重要性,建立的洋虫β-actin基因荧光定量RT-PCR方法简便、特异性强,该体系的建立可用于洋虫蜕皮相关基因表达差异的深入研究。

H9亚型鸭源禽流感病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR快速检测方法的建立

针对H9亚型禽流感HA基因保守序列设计引物,建立基于SYBR GreenⅠ检测模式的荧光定量RT-PCR（real-ti me RT-PCR,RRT-PCR）,最低检测限为8.33×102拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出100倍。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为（83.83±0.22）℃,组内变异系数为0.52%~1.48%,组间变异系数为0.71%~2.21%,可重复性好;对H5亚型禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭源禽1型副粘病毒无扩增;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4.5 h。

检测微囊藻毒素合成酶基因mcyH的SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法的建立

利用RT-PCR方法从铜绿微囊藻PCC7806 mcy基因中扩增出目的基因片段,用TA克隆方法将基因片段插入pGEMT-T Easy中来制备质粒标准品.通过不同连续稀释倍数的质粒标准品成功构建了16srRNA和mcyH两基因的标准曲线,该法构建的两基因标准曲线r2分别为0.9916和0.9938,且质粒标准品具有较好的重复性,满足实时荧光定量RT-PCR的要求.

四步法消除SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR中引物二聚体的影响

为建立一种新的SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR方法 ,使之能够有效消除引物二聚体 (PDs)对实时定量结果的影响 .对RT PCR特异性扩增产物和PDs分别进行了凝胶电泳检测和熔解曲线分析 .依据PDs和扩增产物的熔解温度 (Tm)特点 ,在通用的三步法的延伸步骤之后 ,增加一个短暂的 (5s)恒温和荧光检测步骤 ,使这个步骤的温度高于PDs的Tm,但低于扩增产物的Tm,简称该法为四步法 .PDs的Tm 通常高于 72℃ ,但低于扩增产物的Tm .将四步法第四步的温度设置在高于PDs的Tm ,但低于扩增产物的Tm 时 ,四步法能够有效地消除PDs的影响 .对三步法和四步法SYBRgreenⅠ实时定量RT PCR进行了比较 ,发现三步法根本不能用于RNA的实时定量 ,而四步法能够实现包括低丰度RNA在内的RNA的定量 .选择Tm 值尽可能小的引物 ,使PDs与扩增产物Tm 值之间有足够的差距 ,将更有利于四步法的应用 。

SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。方法巢式RT-PCR扩增SIV病毒RNAgag基因上1360-1837之间的长度为477 bp的片段,将该片段克隆到pGEMT载体上,构建pGEM-SIVgag477质粒。该质粒经限制性内切酶NotⅠ酶切后,进行体外转录,转录出的RNA产物(RS)纯化后10倍系列稀释,作出标准曲线,作为SIV病毒RNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR GREEN RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100 copies/μL。结论制备的RS外标准品纯度高,SYBR Green I荧光染料实时定量RT-PCR法特异性、敏感性高,稳定性好,可用于定量测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数。

马Toll样受体表达水平SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法的建立

旨在建立一种检测马Toll样受体(TLRs)mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(Rverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法。参照GenBank中马TLRs的基因序列保守区设计特异性引物,以马β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立荧光定量RT-PCR方法。结果,扩增曲线在1×102～1×108copies.μL-1范围内有很好的线性关系,扩增相关系数在0.990以上,扩增效率在1.0左右。熔解曲线分析表明,产物为特异单峰,无引物二聚体,具有较高的特异性和灵敏度。重复性结果表明,该方法的组内、组间变异系数均小于3.50%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9在骨髓中均有表达,其中TLR4mRNA表达水平最高,TLR9mRNA表达水平最低。本研究建立的检测方法能够成功用于临床样品的检测,为研究马匹TLRs在mRNA水平的定量分析提供技术平台。

SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用

根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR GreenⅠReal-time RT-PCR检测CDV核酸。以含有83bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线。对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行了敏感性比较。结果表明,该方法能特异性检测到CDV的扩增信号;检测范围在5.2×102～5.2×108拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为96.80%;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;组内变异系数为0.51%～1.90%,组间变异系数为1.96%～2.63%。用建立的Real-time RT-PCR检测11例临床病例,CDV阳性率为100%。对犬瘟热弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24×105～4.88×105拷贝/头份之间。该方法的建立为CDV的早期快速诊断、分子流行病学调查及疫苗质量监测等提供了一种新的快速定量检测手段。

牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。

PRRSV高致病性毒株和经典毒株SYBR GreenⅠ实时荧光PCR鉴别方法的建立

根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性。应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、142、1 d分别采集全血,检测结果均为阳性。证实,本试验所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株。

PPV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪细小病毒(PPV)的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。【方法】根据GenBank中的PPVVP2基因序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR,扩增猪细小病毒VP2基因,并将其纯化的PCR产物克隆入pGEM-T Easy载体中,构建重组质粒。对扩增程序中的荧光染料浓度、引物浓度和Mg2+浓度条件进行优化,建立最佳的荧光定量PCR反应体系和标准曲线。以阳性重组质粒为模板,建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR方法,对其灵敏性、特异性和重复性进行检验。应用建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,对临床60份疑似PPV病料进行检测,同时与血凝试验(HA)和常规PCR方法的检测效果进行比较。【结果】在25μL扩增体系中,Mg2+终浓度为4.5mol/L、SYBR Green染料浓度为20μmol/L、引物浓度为25μmol/L时,本底反应最小、循环阈值最低、扩增效率最高。所建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法能够特异、定量地检测猪细小病毒,灵敏度达20TCID50/mL;在临床样品检测中,其检出率比常规PCR方法高13.3%。【结论】成功建立了PPVSYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,为临床猪细小病毒的早期诊断及定量分析病毒的感染程度奠定了基础。

虎制品的SYB RGreen Ⅰ实时荧光PCR特异性鉴定

针对虎线粒体细胞色素b(Cyt b)基因设计特异性引物,建立并优化SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测鉴定体系。利用该体系分别对从虎(东北虎、孟加拉虎、印支虎)和狮、豹、熊等13种非虎哺乳动物的肌肉、血液、毛发和肉骨粉中提取的DNA进行鉴定分析。结果表明:虎血液、毛发和肌肉DNA样本均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在(83.8±0.1)℃。狮、豹、熊等13种非虎哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。检测灵敏度可达到在骨粉中检出质量分数为0.05%的虎源性成分。SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复性好等特性,可用于虎制品的检测鉴定。

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测网状内皮增生症病毒方法的建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR GreenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR GreenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。

猪伪狂犬病病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

本研究根据猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）的gE基因序列特点,设计特异性实时荧光定量引物,建立基于SYBR GreenⅠ染料的猪PRV实时荧光定量PCR方法。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法检测猪PRVgE基因在7.53×10^1～7.53×10^6拷贝/μL范围内有较好的线性关系;对猪圆环病毒（porcine circovirus2,PCV2）、猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）、副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis）和猪链球菌（Streptococcus susi）核酸均未见阳性扩增信号;从生成的熔解曲线可见,建立的方法仅对猪PRV检测出现单一特异峰,其熔解温度（Tm值）为（92.9±0.1）℃,PCV2、PPV、副猪嗜血杆菌和猪链球菌均未见特异性峰值;建立的实时荧光定量PCR方法的组内和组间变异系数分别为0.31%～1.14%和0.42%～1.74%。以上结果表明,本研究建立的猪PRV实时荧光定量PCR方法敏感性高、特异性强、重复性好,为深入开展猪PRV对宿主致病机制的研究提供检测手段。