SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR GreenⅠ荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium,MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插入序列IS1311为检测靶标设计引物,在60℃的退火温度下,建立鉴定MA的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA,检测限为5.6×10-2 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列IS1311为基础建立的SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。

应用SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线同时检测两种致病菌

SYBR GreenⅠ是一种特异结合双链DNA的染料,已被证明能灵敏地检测核酸。采用SYBRGreenⅠ荧光PCR熔解曲线,通过摸索、优化PCR反应条件及反应体系,扩增出两条不同大小、Tm值不同的目的核酸片段,表现在熔解曲线上出现两个独立的波峰,建立了用SYBR GreenⅠ荧光PCR熔解曲线来检测多个基因的方法,从而实现不用核酸探针,简单、经济、快速的多重荧光PCR方法检测沙门菌和产单核细胞李斯特菌。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

荧光定量PCR探针熔解曲线法在结核分枝杆菌耐药基因检测中的应用研究

探讨在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,观察分析应用价值。方法 本研究的时长段在2022年6月到2023年6月,统共1000例结核患者接受治疗,所有病患都拓展了抗结核药物的测验,且每一位患者的标本均予以荧光定量PCR探针熔解曲线法检测,药物敏感性测定结果为黄金基准,考察判辨荧光定量PCR探针熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的诊断效能。结果 针对1000例的标本中,经过液体药敏试验检测显示对利福平药物耐药例数250例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者;对异烟肼医药有耐药性的液体药敏试验500例,应用溶解曲线检测耐药性包含了470例;经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数170例,予以熔解曲线法显示耐药140例。经过液体药敏试验检测显示对乙胺丁醇药物耐药例数300例,役使溶解曲线观察耐药性包含了240例患者。熔解曲线法对利福平医药品、异烟肼医药品、乙胺丁醇医药品、链霉素医药品的灵敏度分别为84.00%、84.00%、47.06%、66.67%;特异度分别为96.00%、90.00%、84.34%、94.29%;准确度分别为93.00%、97.00%、91.00%、86.00%。结论 在结核分枝杆菌耐药基因检测中,对其予以荧光定量PCR探针熔解曲线法,可得到较高的应用价值,灵敏度、特异度、准确度较高,可筛查结核病患者对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等药物的耐药性,为临床治疗疾病提供可靠的依据。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1 SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立十足目虹彩病毒1(decapod iridescent virus 1,DIV1)的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据DIV1的MCP和ATPase基因序列,设计并筛选出引物,以制备的DIV1阳性质粒标准品为模板构建标准曲线,建立DIV1的SYBR Green I qPCR方法,并对该方法进行临床初步应用。结果显示,建立的qPCR方法阈值循环数(cycle threshold value,Ct)与标准品拷贝数的对数线性关系良好,标准曲线相关系数(R^(2))为0.999;对DIV1阳性的虾蟹核酸样本能够进行特异性扩增,但对传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)和白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)阳性核酸样本均无扩增;最低检测限为9.77 copies/μL;Ct值的组内和组间变异系数均小于1%。运用该方法对70份疑似感染DIV1的虾蟹类样本进行DIV1检测,该方法阳性率为48.57%,与套式PCR检测方法的阳性率一致;利用建立的方法对DIV1阳性三疣梭子蟹的血淋巴、肝胰腺及心脏等组织进行定量检测分析,结果显示各组织中均存在DIV1,其中血淋巴中DIV1平均拷贝数最高。研究表明,建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于对DIV1的快速、定量检测,对十足目虹彩病毒病的诊断和防控具有重要意义。

华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为了建立一种特异且敏感的华支睾吸虫囊蚴SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,试验针对华支睾吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基1(CSCOⅠ)基因设计特异性引物,筛选最佳引物浓度和退火温度,绘制标准曲线,优化扩增体系和程序建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并评价该方法的敏感性、特异性、重复性及符合性。结果表明:最佳引物浓度为750 nmol/L,最佳退火温度为57℃。标准曲线的斜率为-3.21,截距为35.23,相关系数(R^(2))为0.9823。该方法的最低检出限为1×10^(2)copies/μL;批间和批内变异系数分别为1.53%~2.59%和0.36%~0.76%,表现出良好的重复性;仅标准阳性质粒、华支睾吸虫囊蚴及肝片吸虫出现特异性扩增曲线,具有较好的特异性;与传统压片镜检法比较符合率为96%。说明试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法敏感、特异、稳定,为后续开展淡水鱼感染华支睾吸虫囊蚴的流行病学调查提供了技术支持。

猪圆环病毒1型、2型、3型SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR鉴别方法的建立及应用

猪圆环病毒(PCV)包括猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)。近些年来,PCV1、PCV2、PCV3基因型之间存在共感染,因此建立一种快捷、特异、敏感的PCV1、PCV2、PCV3的SYBR GreenΙ实时荧光定量PCR鉴别检测方法显得尤为必要。本试验通过特异性引物筛选,各项反应条件优化,建立了实时荧光定量PCR鉴别方法。结果表明:PCV1、PCV2、PCV3检测下限分别为40.3、25.2、22.4 copies/μL。与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)均无交叉反应。批内及批间变异系数均小于1%。对98份PCV疑似阳性病料检测结果表明,PCV1、PCV2、PCV3感染率分别为10.2%、65.3%、53.1%,共感染率为7.1%。该方法具有良好的特异性、敏感性和稳定性,为PCV1、PCV2、PCV3的早期检测、定量检测及后期研究提供了技术手段。

空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示:建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数(CV)均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。

荧光PCR探针熔解曲线技术检测痰标本中结核分枝杆菌异烟肼耐药性的研究

目的评价荧光PCR探针熔解曲线(fluorescence polymerase chain reaction probe melting curve,Melt Pro)技术检测痰标本结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)异烟肼耐药性的应用价值。方法收集2021年5月至2022年5月在北京市疾病预防控制中心结核病门诊Gene Xpert MTB/RIF检测为MTB的(简称MTB阳性)患者痰标本,对每份标本同时进行涂片镜检、分枝杆菌分离培养、Melt Pro技术和线性探针技术(Geno Type MTBDRplus,简称Hain试验)异烟肼耐药检测。分析Melt Pro技术检测痰标本MTB异烟肼的耐药性,痰标本荷菌量对检测结果的影响;以培养阳性菌株异烟肼比例法药敏结果为参考标准,评价Melt Pro技术耐药检测效能。结果收集MTB阳性的合格痰标本157例,经分枝杆菌分离培养获得阳性菌株130株。Melt Pro技术痰标本MTB异烟肼耐药性检测成功率为84.1%(132/157)。不同痰涂片结果等级间,Melt Pro技术检测异烟肼耐药成功的比例差异存在有统计学意义(H=24.169,P=0.000),随痰涂片结果等级的升高,检测成功率由“阴性”标本的64.8%(35/54)升高到“3+”“4+”标本的100%(17/17,6/6);该比例也随Gene Xpert MTB/RIF检测MTB等级的升高而升高,由“极低”标本的54.8%(17/31),到“高”标本的96.4%(27/28),各等级间差异有统计学意义(H=27.763,P=0.000)。Melt Pro技术、Hain试验和药敏试验的异烟肼耐药检出率分别为22.0%(29/132),15.3%(19/124),和14.6%(19/130),三者差异无统计学意义(χ^(2)=2.997,P=0.223)。以培养阳性菌株比例法药敏试验结果为参考标准,Melt Pro技术检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:84.6%(11/13)、91.2%(93/102)、55%(11/20)、97.9%(93/95),Kappa值为0.614;Hain试验检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:55.6%(10/18)、92.3%(84/91)、58.8%(10/17)、91.3%(84/92),Kappa值为0.490。结论Melt Pro技术可直接检测痰标本MTB耐药性,快速准确筛查患者耐药情况,缩短耐药筛查时间。

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法,本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物,分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对2种方法进行了综合比较。结果显示,TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10^(1) copies/μL和1.0×10^(2) copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性;重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品,2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明,2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。

荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物耐药性的诊断价值

目的 评价荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类药物(卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素)耐药性的诊断价值。方法 收集2018年1月~2019年5月在浙江大学医学院附属杭州市胸科医院收治的培养阳性且具有荧光PCR熔解曲线和BACTEC MGIT 960药敏结果的205例资料。以BACTEC MGIT960药敏结果为金标准,评价荧光PCR熔解曲线法对抗结核药物利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类药物耐药性的诊断价值。结果 荧光PCR熔解曲线法敏感而BACTEC MGIT960药敏耐药的例数,在利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类分别为1、9、1、1例。荧光PCR熔解曲线法耐药而BACTEC MGIT960药敏敏感的例数,在利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类分别为2、1、2、0例。两种技术方法的总体符合率,在利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类分别为98.54%、95.12%、98.54%、99.51%。荧光PCR熔解曲线法检测利福平耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别是96.96%、98.84%、94.12%、99.42%、0.946,对异烟肼耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别是80.43%、99.37%、97.37%、94.61%、0.851,对氟喹诺酮耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别是93.33%、98.94%、87.50%、99.47%、0.895,对二线注射类药物耐药性的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、Kappa值分别是85.71%、100.00%、100.00%、99.50%、0.921。结论 荧光PCR熔解曲线法对利福平、异烟肼、氟喹诺酮、二线注射类药物的耐药性有较好的辅助诊断价值,适合临床结核病患者的早期耐药性筛查。

SYBR Green II荧光定量PCR结合熔解曲线鉴别不同亚型兔病毒性出血症病毒方法的建立

本研究建立了一种荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)结合熔解曲线区分不同亚型兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)方法。根据GenBank数据库中已公布的不同亚型RHDV(经典RHDV和RHDV2)的衣壳蛋白VP60序列保守区设计了1对特异性引物,利用SYBR Green II荧光染料,在实时荧光定量PCR方法的基础上结合熔解曲线进行分析,经典RHDV和RHDV2熔解温度(Tm)分别为(86.3±0.1)℃和(85.1±0.1)℃,扩增产物的熔解曲线分析均只出现单特异峰。结果表明,本研究建立的方法能够快速地鉴别经典RHDV和RHDV2。

SYBR Green I荧光PCR熔解曲线鉴定鸟分枝杆菌方法的建立及初步应用

目的基于SYBR Green I荧光染料建立鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium.MA)的荧光PCR熔解曲线法,为临床鉴定MA提供简单、准确性高的分子生物学检测方法。方法以MA的特异性插人序列ISI311为检测靶标设计引物,在60 C的退火温度下,建立鉴定MA的SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法,并对MA等21种分枝杆菌标准株和金黄色葡萄球菌等5种常见致病菌进行检测,评价方法的特异性、检测限;以hsp65、16S rDNA普通PCR扩增产物测序分析为“金标准”,鉴定200株分枝杆菌临床分离株,评估建立方法鉴定MA的准确性。结果SYBRGreenI荧光PCR熔解曲线方法在30个循环内能准确鉴定出21种分枝杆菌标准株和5种致病菌中的MA.检测限为5.6x 102 ng/μL。200株分枝杆菌临床分离株中,以PCR测序鉴定出16株MA和184株其他分枝杆菌,以SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法鉴定出15株MA和185株非MA;本研究建立的方法和测序方法对MA的鉴定率差异无统计学意义(P>0.05);两法符合率为99.5%(199/200),一致性较高(Kappa值>0.75,P<0.01);建立方法的敏感性为93.8%(15/16),特异性为100.0%(184/184),阳性预测值为100.0%(15/15),阴性预测值为99.5%(184/185)。结论以MA特异性重复序列ISI311为基础建立的SYBR Green I荧光PCR熔解曲线方法,具有较高的灵敏度和特异性,为MA的临床检测提供新的途径。

Ⅰ群禽腺病毒SYBR GreenⅠ荧光PCR检测方法的建立

根据GenBank中Ⅰ群禽腺病毒六邻体基因的保守序列设计了1对引物，建立了检测Ⅰ群禽腺病毒12个血清型的SYBR GreenⅠ荧光PCR方法。用Ⅰ群禽腺病毒阳性样品进行了特异性、敏感性和重复性试验。结果显示。该方法可检测到每个反应相当于1×10^2个拷贝的标准品DNA，与鸡减蛋综合征病毒、禽呼肠孤病毒、传染性腔上囊炎病毒和传染性支气管炎病毒等非Ⅰ群禽腺病毒不发生交叉反应，具有良好的重复性。对保存的3份Ⅰ群禽腺病毒的细胞培养物进行荧光定量PCR检测，结果都为阳性，检测的病毒含量为1×10^6～1×10^8拷贝／μL。表明．建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点，可用于临床上Ⅰ群禽腺病毒感染的检测。

禽源沙门氏菌荧光定量PCR方法的构建及应用

试验旨在建立一种快速检测禽源沙门氏菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR(qPCR)的方法,即根据沙门氏菌invA基因的保守序列设计引物,利用普通PCR方法扩增沙门氏菌invA基因保守基因片段,将其克隆到pMD18-T载体上,将获得的重组质粒pMD18-T-invA作为标准阳性模板。经qPCR条件优化后,进行特异性、灵敏性和重复性试验。结果显示,所建立的SYBR Green Ⅰ qPCR方法的Ct值与标准品在1.4~1.4×10^(10)拷贝/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.9963,扩增效率为95%,检测下限为1.4拷贝/μL;与大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、痢疾志贺菌、多杀性巴氏杆菌无交叉反应;该方法组内变异系数和组间变异系数均小于2.5%;对44份粪便样本和132份蛋液样本进行qPCR方法和常规PCR方法检测,结果显示该qPCR方法的阳性检出率分别为22.7%(10/44)、0.8%(1/132),常规PCR的阳性检出率分别为9.1%(4/44),0%(0/132)。结果表明:试验成功建立禽源沙门氏菌qPCR检测方法,可为禽源沙门氏菌的快速检测提供技术支撑。

基于SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR建立生乳及乳制品沙门氏菌快速检测技术

生乳易受沙门氏菌污染,并大量繁殖;经加工的乳制品细菌数大大减少,但仍存在沙门氏菌污染的风险。试验按生乳及乳制品沙门氏菌污染水平研究样品前处理方法,采用煮沸裂解法快速提取总DNA,针对沙门氏菌invA基因建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR快速检测技术。建立的方法具有良好的特异性和较高的灵敏度,其中生乳沙门氏菌检出限为102cfu.mL-1,方法的检测线性范围为102～108cfu.mL-1,相关系数(R2)为0.999,扩增效率为103%;乳制品沙门氏菌经16 h增菌后检出限达到1 cfu.[25 g(mL)]-1。该技术可用于生乳中沙门氏菌的高效筛查及定量检测,检测一个样品仅需3 h;同时,可用于乳制品的准确定性检测,检测周期为1 d;且方法重复性好、准确度高、操作简单,为乳制品企业快速检测沙门氏菌提供了有效的技术手段。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒因子P1

该研究旨在建立快速、敏感和特异的检测类猪圆环病毒因子P1的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR法,用于P1的早期诊断。以感染P1的猪血清DNA提取物为模板,采用PCR扩增P1 101 bp的基因片段,将其克隆至pMD18-T载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段属于P1,所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1的反应在101-108拷贝/μL之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10拷贝/μL,而对猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。成功建立了SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测P1载量的方法,为P1致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。

牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种检测牛分枝杆菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR,为防控牛结核病提供技术支持。【方法】根据牛分枝杆菌特异性基因序列(No.MBU87961,gi9954088)设计合成一对扩增牛分枝杆菌的特异性引物,从引物设计、各成分配比、样品采集及样品DNA提取等方面进行优化,并对建立的方法进行标准曲线、溶解曲线分析及特异性、敏感性、重复性、临床样品检验试验。【结果】牛分枝杆菌SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的检测模板范围为1.0×109～1.0×10拷贝/μL时,其标准曲线呈良好的线性关系,溶解曲线表现为单一波峰,Tm值为86.48～86.65℃。SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的牛型分枝杆菌扩增结果为阳性,其他参试菌株均为阴性;可检测出10拷贝/μL的牛分枝杆菌DNA,敏感性是常规PCR的100倍;Ct值变异系数小于5%,重复性好;对50份PPD检测为阳性的牛鼻黏液、牛奶和淋巴结进行检测,其结果与常规PCR检测结果一致。【结论】建立的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR具有快速、便捷、准确等优点,适合于牛分枝杆菌的鉴别诊断。