SYBR Green实时荧光PCR检测食品中鲨鱼源性成分真实性方法的建立

为确保鲨鱼产品的真实性,作者研究建立了食品中鲨鱼源性成分的SYBR Green实时荧光PCR鉴定方法。运用建立的SYBR Green实时荧光PCR方法对9种鲨鱼及48种常见非鲨鱼类动植物样品进行检测,9种鲨鱼样品均出现扩增曲线,且熔解曲线在(84±1.5)℃内出现峰值;其他非鲨鱼样品中均未出现扩增曲线,熔解曲线在(84±1.5)℃也未出现峰值。该检测方法的检测限为0.000 1 ng/μL鲨鱼DNA和质量分数0.01%狗鲨肉粉。运用建立的方法对20种常见的鲨鱼产品进行PCR检测,除仿鱼翅和鲨鱼肝油外所有产品中均能检测出鲨鱼成分。结果表明,该检测方法特异性强,灵敏度高,能够用于食品中鲨鱼源性成分的真实性鉴别。

SYBR Green实时荧光PCR高通量检测转基因大豆油

采用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立了食用大豆油转基因成分的检测方法。根据转基因大豆中内源参照基因lectin和外源基因35S启动子、NoS终止子和cp4 epsps基因,设计特异性引物,在Roche荧光PCR仪上进行实时荧光PCR扩增。荧光曲线表明,SYBR Green实时荧光PCR可特异性地检测大豆油中的转基因成分,方法准确、快速,并运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性,检测方法灵敏度高。

NDM-1基因新型染料EverGreen实时荧光PCR检测方法的建立

研究初步建立了NDM-1基因的实时荧光PCR快速检测鉴定方法。研究根据超级细菌NDM-1序列,设计并合成了检测引物(ND-E-F和ND-E-R),对NDM-1质粒DNA和其他11个标准菌株进行了EVERGREEN实时荧光PCR检测。结果表明,携有NDM-1基因的质粒DNA模板都出现了很强的特异信号,而其他对照病菌均未出现特异荧光信号,证明这套引物及探针具有NDM-1基因检测的特异性。灵敏度测定结果,此体系可检出10fg/μL质粒DNA模板。研究表明,EverGreen实时荧光PCR方法是一种特异、灵敏、快速的NDM-1基因检测方法。

SYBR-Green实时荧光PCR检测转基因番木瓜

分别以RBCL基因和PRSV-CP基因、PRSV-RP基因为内源基因和目标基因,设计了3对特异性引物,对转基因番木瓜进行了SYBRGreen实时荧光PCR检测.结果表明,RBCL基因引物对所有供试样品成功扩增,Ct值为15～16,PRSV-CP引物对转PRSV-CP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为20～25,PRSV-RP引物对转PRSV-RP基因番木瓜样品成功扩增,Ct值为21～22.运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性.

SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇技术

应用SYBR Green实时荧光PCR技术,建立SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣实蝇（mtDNA）中COⅠ基因序列,设计筛选出1对种的特异引物CarF/CarR。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种实蝇来验证。SYBR Green PCR实时荧光反应的灵敏度用40,20,10,1,0.1,0.01,0.001 ng·μL^-1 7个浓度枣实蝇DNA模板来检测。结果表明：SYBR Green PCR的检测限度达0.01 ng·μL^-1以下,最适模板DNA浓度为1～20 ng·μL^-1。SYBR Green实时荧光PCR的可靠性可用枣实蝇不同虫态（幼虫、蛹、成虫）的扩增曲线、熔解曲线及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳来检验。成虫、幼虫和蛹3种不同虫态的枣实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳条带分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性;其平均熔解温度为（75.3±0.1）℃,并获得一段长为205 bp的特异性目标片段,说明在枣实蝇成虫为模板的基础上建立的SYBR Green实时荧光PCR方法同时适用于幼虫、蛹的快速鉴定,可将不同虫态的枣实蝇与近似种类区分开来。

SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇

本文应用SYBRGreen实时荧光PCR技术,建立了SYBRGreen实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇的方法。利用辣椒实蝇mtDNACOI基因序列,筛选出种特异引物lati1/lati2。引物的特异性分别用辣椒实蝇、橘小实蝇、木瓜实蝇、杨桃实蝇、菲律宾实蝇、芒果实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇和南瓜实蝇等9种果实蝇来验证。0.01ng,0.1ng,1ng,10ng,20ng,40ng和100ng等7个不同浓度系列的辣椒实蝇DNA模板用来检测SYBRGreenPCR实时荧光反应的灵敏度,结果表明,SYBRGreenPCR的检测限度达1pg以下,最适模板DNA浓度为1～20ng。成虫、幼虫和蛹等3种不同虫态的辣椒实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性。其平均熔解温度为77.5℃±0.1℃。获得1段长为366bp的特异性目标片段,说明在辣椒实蝇成虫为模板基础上建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法适于幼虫、蛹的快速鉴定。

中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法的建立

根据NCBI上已公布的中华鲟D-loop基因、细胞色素b基因、12S rRNA基因的核酸序列设计出4对引物,经SYBR Green实时荧光PCR反应、熔解曲线分析和扩增片段克隆测序后,发现针对D-loop基因的F2-R1引物能够高效、特异地实现对靶序列扩增,选择其作为中华鲟基因特异性扩增引物,建立中华鲟基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法。所建立的中华鲟D-loop基因SYBR Green实时荧光PCR检测方法特异性好、可操作性强,具有较好的应用价值。

EvaGreen实时荧光PCR检测猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)方法的建立和应用

目前,猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)已成为全球范围内影响较广的猪类重要疾病之一,因此建立快速、有效的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测技术成为预防和控制PRRS传播的关键。在序列分析的基础上,设计特异性引物,建立基于熔解曲线分析的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法。该方法能够特异性扩增PRRSV,并用经熔解曲线分析产生特异性的熔解峰,而非靶标病毒未产生非特异性扩增;PRRSV的检测灵敏度可达50 copies/μL;批内、批间重复试验中变异系数均在2%以内;对118份临床样品进行检测,阳性率为31.4%,与普通PCR检测结果相符率为100%。结果表明,建立的Eva Green实时荧光定量PCR检测PRRSV方法具有较高的特异性、灵敏度和良好的重复性,可用于临床PRRSV感染的早期诊断及分子流行病学调查。

鸡传染性喉气管炎病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus,ILTV)以往多感染蛋鸡,近年来在蛋种鸡、商品肉鸡中连续多发,表明该病毒感染谱有扩大风险,因此有必要加强对ILTV的监测。为建立高效、灵敏的ILTV检测方法,本研究以ILTV的TK基因为靶基因设计引物,扩增并构建pMD18-T-TK质粒标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法和标准曲线,对其特异性、敏感性和重复性进行验证,并对临床疑似病例进行检测。结果发现,该检测方法特异性良好,与其他常见症状相似病原无交叉反应;最低检测浓度为1.55拷贝/μL,灵敏度是普通PCR方法的10倍;重复性好,批内、批间变异系数在0.79%~1.83%之间。表明本研究建立的ILTV实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高,可为ILTV的临床诊断和流行病学研究等提供有效的检测方法。

美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)普通PCR和SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立美洲鳗鲡腺瘤病毒(AEAdoV)的检测方法,根据AEAdoV福建株(AEAdoVFJ)的superfamily 3 helicases(S3H)序列,设计引物,建立了AEAdoV的普通PCR和qPCR检测方法;进一步评价检测方法的灵敏性、特异性及重复性,利用2种方法对美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料进行了检测,并对美洲鳗鲡体内不同组织的病毒含量进行分析。结果显示,普通PCR扩增的目的片段长度约300 bp,利用其构建的qPCR质粒标准品,其拷贝数与qPCR阈值循环数(C_(t))线性关系良好,线性范围广,标准曲线相关系数(R2)达到0.999,扩增效率为105.067%。建立的普通PCR法和qPCR的最低检测AEAdoV拷贝数分别为100个和10个。2种方法均可特异性检测AEAdoV,而对蛙虹彩病毒(RGV)、鳗鲡疱疹病毒(AngHV)、鲤疱疹病毒(KHV)、对虾白斑综合征病毒(WSSV)、日本鳗鲡内皮细胞坏死病毒(JEAdoV)和花鳗鲡腺瘤病毒(MEAdoV)均无扩增反应。qPCR法的组内和组间变异系数均小于2%,表明其重复性良好。临床应用结果显示,35份美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病料,采用普通PCR法的AEAdoV检出率为82.8%,而qPCR法的AEAdoV检出率为97%。对美洲鳗鲡不同组织的病毒含量分析结果显示,心脏、肝脏、鳃、鳍的AEAdoV相对含量较高,而黏液、皮肤和脾脏的病毒含量相对较低。研究表明,建立的AEAdoV的灵敏度高、特异性强的普通PCR和qPCR检测方法,证实AEAdoV与美洲鳗鲡“出血性烂鳃”病密切相关,且在感染鳗鲡主要组织中都存在。实验结果对于研究AEAdoV的致病性,开展其流行情况和病原学情况分析具有重要意义。

猪流行性腹泻病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立高效、灵敏的猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测方法,本研究从GenBank数据库中获取PEDV N基因序列,扩增出PEDV N基因标准质粒,并在N基因的保守区域内设计了一对特异性荧光定量引物,成功建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法。经过一系列试验表明,该检测方法线性关系良好,R^(2)值为0.99;特异性强,敏感性高,最低可检测至2.23 copies/μL,比普通PCR灵敏约100倍;重复性好,组内变异系数为0.25%~0.43%,组间变异系数为0.67%~0.97%;对于各地区96份临床样品检测出PEDV阳性率为25%。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法为PEDV的临床诊断、流行病学调查以及定量研究提供了有效的检测工具。

鸡圆环病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测鸡圆环病毒(CCV),试验根据CCV Rep基因设计特异性引物,以CCV阳性病料提取的DNA为模板进行PCR扩增,构建CCV重组质粒,建立检测CCV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:试验建立的方法对2.87×10^(8)~2.87×10^(1)copies/μL浓度范围的CCV重组质粒标准品呈现良好的线性关系,相关系数(R^(2))为0.9936,灵敏度比常规PCR高100倍;该方法对鸡传染性贫血病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒等常见鸡病毒性病原以及多杀性巴氏杆菌、禽致病性大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌无特异性扩增,批内和批间变异系数均不超过1%;该方法对60份疑似CCV感染临床样品检测结果显示,CCV阳性检出率(16.67%)高于常规PCR。上述结果表明,研究建立的CCV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,检出限为2.87×10^(1)copies/μL,可以用于CCV的快速定量检测。

水禽细小病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为了建立水禽细小病毒(WPV)快速检测方法,根据序列比对结果在水禽细小病毒NS基因SF3保守区域内设计特异性引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR通用检测方法。该方法的扩增效率(E)为90.0%,相关系数(R~2)=0.99,标准曲线方程为y=-3.607x+38.77;除WPV出现S形扩增曲线外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鸭肝炎病毒(DHAV)、鸭肠炎病毒(DEV)、鸭呼肠孤病毒(DRV)样品均未出现S形阳性扩增曲线;批内变异系数(CV)为0.15%~0.23%,批间变异系数为0.09%~0.28%。结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法重复性好、灵敏度高和特异性强。临床样品检测结果表明,SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR与普通PCR的符合率达98.4%,灵敏度是普通PCR的1 000倍。SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法不仅能定性检测WPV,还可以进行定量检测,可用于种鸭场、种鹅场的WPV净化检测,也可用于WPV临床大量样品的快速检测。

绿豆象实时荧光定量PCR内参基因的筛选

绿豆象Callosobruchus chinensis是一种世界性分布的害虫,对绿豆、豇豆等豆科作物的产量与品质造成严重影响。本研究旨在筛选出适合分析绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中稳定表达的内参基因,根据绿豆象转录组测序以及相关参考文献报道,筛选出8个候选内参基因(β-Actin、β-Tubulin、α-Tubulin、AK、GAPDH、RPL40、Hsc70、eEF1-α),采用qRT-PCR技术分析在绿豆象不同发育阶段(幼虫、蛹、雌雄成虫)以及成虫不同组织中的(触角、头、腹、足、翅)各候选基因的表达量;利用GeNorm、NormFinder、BestKeeper和在线网站RefFinder并结合△Ct值评估8个候选内参基因的稳定性。结果显示,在绿豆象不同发育阶段以及成虫不同组织中,各候选内参基因Ct值和跨度均不同,表明各候选内参基因表达量存在差异。不同算法综合比较内参基因稳定性以及GeNorm软件最佳内参基因数目的分析显示,在绿豆象虫不同发育阶段中推荐采用β-Act、β-Tub作为内参基因,而在绿豆象成虫不同组织中推荐采用β-Tub、α-Tub作为内参基因,这有利于在绿豆象的基因表达研究中取得更为可靠、准确的数据。

低温弱光胁迫下茄子幼苗实时荧光定量PCR内参基因的筛选与评价

为了探索茄子Solanum melongena L.的基因表达模式,利用qRT-PCR方法分析了茄子ACT、EF1α、TUA、TUB、GAPDH、eIF、UBQ、UBI3、PP2A、CYP、RPL28、L25、SAND、TBP、DNAJ、APRT、EXP、CAC、HSP20和CysPro 20个候选内参基因mRNA的表达差异情况,并运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper 3种计算方法评价茄子20个候选内参基因在低温、弱光、低温弱光叶片样品中的表达稳定性。结果表明:茄子20个候选内参基因荧光定量引物扩增效率(E)数值在96.8%~117.6%,相关系数(R^(2))介于0.9688~0.9999,扩增效率良好,扩增反应具有高度的专一性,引物能特异性扩增,特异性好,均为单峰,样品间扩增曲线重复性强,可用于qRT-PCR扩增。茄子20个候选内参基因C_(T)值表达丰度分析,发现茄子20个候选内参基因平均CT值在19.76~31.20。3种计算方法的综合评价分析结果显示,TBP基因在所有样本中为最稳定的内参基因。研究可为茄子低温、弱光和低温弱光胁迫下基因特异性表达研究提供了合适的内参基因。

在生物科学综合实验引入实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR技术是核酸定量分析的重要方法,是分子生物学领域的前沿技术,广泛应用于基础生物学研究、肿瘤诊断、病毒检测和食品检测等领域。在“生物科学综合实验”课程中引入此项技术,丰富了课程内容,也提高了课程的挑战度。经过教学实践,取得了良好的效果。学生不仅掌握了扎实的实践技能和前沿的科研方法,还提高了数据分析与处理的能力。

食品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌实时荧光PCR检测的研究

目的:建立唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的核酸检测方法。方法:根据16S~23S rRNA基因片段序列,利用Oligo7设计TaqMan探针及引物,并验证实时荧光PCR检测方法的特异性和灵敏性。结果:用实时荧光PCR检测方法检测15株标准菌株,只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌呈阳性,验证了此方法具有良好的特异性。灵敏度实验中得出菌液灵敏度为5.8×10~2 CFU·mL^(-1),DNA灵敏度为7.2×10^(-4) ng·μL^(-1)。结论:建立的实时荧光PCR检测方法有良好的特异性和灵敏度,该方法可用于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的快速检测,具有较好的应用价值。

槟榔黄化植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

槟榔是海南省重要的热带经济作物,由植原体侵染引起的槟榔黄化病(areca palm yellow leaf disease,YLD)是当前我国槟榔生产上的一种毁灭性病害。为了建立精准高效的槟榔黄化植原体检测方法,本研究基于槟榔黄化植原体16SrDNA基因,设计并合成特异性引物AMf/AMr和探针AM-Prode,使用该方法进行准确性、敏感性、特异性及重复性测试,并在其他植物的植原体病害进行检测。结果显示:本检测方法能够准确的检测出阳性样品,健康样品无扩增曲线;在敏感性测试中,该检测方法能检测到1.16×10^(1) copies/μL样本浓度水平,其标准曲线方程为y=-3.4185x+43.624,扩增效率为96.12%,相关系数R^(2)=0.9833;在特异性测试中,该检测方法对YLD的检测具有较好的特异性,槟榔、槟榔其他病害病原及其内生菌的基因组对本方法未造成干扰;在重复性测试中,该检测方法对槟榔黄化病的检测具有较好的重复性;并且该检测方法可对苦楝黄化病、细圆藤丛枝病及辣椒黄化病等8种植原体病害进行检测,对植原体的检测具有一定的通用性。本检测方法的建立,有利于为槟榔黄化病的精准诊断、病原监测及媒介昆虫的检测等研究提供可靠的技术手段。

水貂圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为快速检测水貂圆环病毒(MiCV),本试验根据MiCV Cap基因序列设计合成特异性引物,建立了水貂圆环病毒SYBR Green II实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法在模板浓度为1.0×10^(6)~1.0×10^(1) copies/μL范围内呈良好线性关系,相关系数为0.9983。本试验建立的检测方法对水貂阿留申病毒、猪圆环病毒2型、水貂肠炎病毒、犬瘟热病毒和猪伪狂犬病毒进行检测均无特异性扩增,批内和批间CV均小于2%,对重组阳性质粒的检测下限为1.0×10^(1) copies/μL,比普通PCR的敏感度高100倍,对阳性样品DNA的检测下限为2.38×10^(-2) pg/μL,比普通PCR的敏感度高1000倍。应用该方法对吉林省部分毛皮动物养殖场的水貂、狐狸、貉和环境样品进行检测,结果其阳性率分别为57.23%、48.42%、39.71%和68.48%。上述结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,为MiCV的诊断及流行病学调查提供技术支持。

3型哺乳动物正呼肠孤病毒SYBR Green I荧光定量PCR方法的建立及应用

哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV)是双链RNA病毒,可以感染自然宿主的哺乳动物和脊椎动物。为建立一种针对3型哺乳动物正呼肠孤病毒(MRV-3)的特异且快速的检测方法,本研究根据Genbank登录的MRV-3(OQ627746-OQ627755)S1基因保守区设计1对特异性引物,并从MRV-3中扩增S1基因,构建重组质粒p MD18-S1,经PCR和测序鉴定正确后作为质粒标准品,经反应体系及反应条件优化后首次初步建立了检测MRV-3的SYBR Green I荧光定量PCR(q PCR)方法。将质粒标准品10倍倍比稀释后作为模板经该q PCR扩增,建立标准曲线,结果显示,质粒标准品在1.3×10^(8)拷贝/μL~1.3×10^(3)拷贝/μL与各自的Ct值均呈良好的线性关系,斜率为-3.1706,R^(2)为0.9999,熔解曲线为单峰。以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛肠道病毒(BEV)、水牛匈爱病毒(Buf Hu V)、牛冠状病毒(BCo V)、牛细小病毒(BPV)和MRV-3的基因组DNA/c DNA为模板,利用本研究建立的q PCR方法检测,评估该方法的特异性;将质粒标准品10倍倍比稀释至1.3×10^(2)拷贝/μL~1.3×10^(8)拷贝/μL后作为模板,分别利用本研究建立的q PCR和常规PCR检测,比较两种方法的检测结果,评估本研究建立q PCR方法的敏感性;以1.3×10^(3)拷贝/μL~1.3×10^(7)拷贝/μL 5个不同浓度的质粒标准品为模板,利用该方法分别进行批内和批间的重复性试验,评估该方法的重复性。结果显示,该方法只能检测出MRV-3,其他相关病原的检测结果均为阴性;该q PCR对质粒标准品的检测限为1.3×10^(3)拷贝/μL,比常规PCR敏感性高10 000倍;批内和批间重复性试验的变异系数均小于或等于1.0%,表明该q PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好。利用该方法检测220份牛粪便样品,结果显示MRV-3的检出率(3.64%,8/220)高于常规PCR的检出率(1.36%,3/220),两种检测方法的阳性符合率达100%,阴性符合率为97.75%,总符合率为97.78%。综上所述,本研究首次建立的检测MRV-3的SYBR Green I q PCR方法可以用于临床牛腹泻病原的检测,为MRV-3尤其是牛源MRV-3提供了一种快速灵敏的检测手段,也为MRV-3的后续研究奠定了基础。