PCR-RFLP技术与结合SYBR GreenⅠ荧光染料的实时荧光PCR技术对HBV拉米夫定耐药基因检测效果分析

目的分析PCR-限制性片断长度多态性(PCR-RFLP)技术和结合SYBR GreenⅠ荧光染料的实时荧光PCR技术检测HBV拉米夫定耐药基因的效果。方法采用PCR-RFLP技术和结合SYBR GreenⅠ荧光染料的实时荧光PCR技术检测186例份乙肝血清标本拉米夫定耐药HBV DNA聚合酶204、180位点基因突变情况,并进行DNA测序验证。结果两种方法在HBV DNA聚合酶204位点均检出YIDD、YVDD、YMDD/YIDD、YMDD/YVDD、YIDD/YVDD突变类型,未检测出YSDD突变类型,检测结果与DNA测序验证结果比较差异均无统计学意义(χ~2=2.101、1.614,P均>0.05)。两种方法在HBV DNA聚合酶180位点均检出L180M、L180M+M204I、L180M+M204V突变类型,检测结果与DNA测序验证结果比较差异均无统计学意义(χ~2=0.054、1.614,P均>0.05)。结论 PCR-RFLP技术和结合SYBR GreenⅠ荧光染料的实时荧光PCR技术均可用于HBV拉米夫定耐药基因突变检测,但后者更适合大规模耐药基因突变筛查。

实时荧光PCR检测γ-干扰素对大鼠神经干细胞versican基因表达的调控

目的建立检测硫酸软骨素蛋白多糖versican不同亚型mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察炎症因子γ-干扰素对大鼠神经干细胞中不同versican亚型基因表达的调控。方法分离孕大鼠胚胎的神经干细胞,在含有营养因子的基质中进行体外培养。当加入处理因素γ-干扰素并作用48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据versican不同亚型的基因序列,设计特异性不同的引物,利用ABI7900PCR仪和SYBR Green,建立优化的实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct(△△Ct)进行基因表达的相对定量分析。结果熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证实了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,γ-干扰素可以上调versican V2基因的表达,但对versican V1的表达无影响。结论应用SYBR Green实时荧光PCR可以特异、准确、快速地分析versican不同亚型的基因表达差异,为系统研究其复杂的调控机制创造了有力条件。

抗除草剂转基因作物实时荧光定量PCR检测

建立了一种以SYBR Green Ⅰ为结合染料、快速准确检测转抗除草剂基因成分的实时荧光定量PCR方法.以转基因大豆与转基因玉米标准品为材料,通过使用特异性引物和SYBR Green I结合染料实时荧光定量PCR技术,对转基因农作物中外源抗除草剂基因进行了定量检测,绘制了两种基因扩增的标准曲线图,根据标准曲线方程计算外源基因含量;并作了溶解曲线、检测方法检测灵敏度和精密度的分析.研究发现,两者标准曲线方程线性关系良好,R2值分别达到0.9939与0.9924.通过已知标准品进行验证,实测值与真值接近,与实际含量的相对偏差是6.52%和7.90%.结果表明,SYBR Green I结合染料法完全可以用于转基因农作物定量PCR检测.

基于牛呼吸道合胞体病毒F基因TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法的建立

为了对牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)进行准确定量检测,针对BRSV F基因设计特异性引物,构建pMD19T-BRSV-gF重组质粒,以其为模板优化反应条件及反应体系,建立TB GreenⅡ荧光定量PCR方法并应用于临床BRSV检测。结果显示,针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR方法标准曲线线性关系良好,相关系数为0.9952;灵敏度高,BRSV最低检测限达3.9×10^(1) copies/μL;特异性良好,可特异性检测出BRSV,对牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒的扩增呈阴性;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数均小于2%。对50份临床样品进行检测,荧光定量PCR对BRSV的阳性检出率(26%)明显优于常规PCR方法(14%)。结果表明针对BRSV F基因建立的TB GreenⅡ荧光定量PCR检测方法适合BRSV的临床检测。