应用SYBR greenI荧光PCR研究GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间的相关性

背景与目的谷胱甘肽S转移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)基因是参与体内多种致癌物代谢的重要的II相代谢酶,其基因多态性被认为与人肺癌遗传易感性有关。本研究旨在探讨天津地区汉族人群GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间的关系。方法采用SYBR green I实时荧光PCR熔解曲线分析方法检测天津地区265例肺癌患者和307例对照者GSTM1基因多态性,应用病例对照研究分析其与肺癌易感性及不同病理类型之间的关系。结果①GSTM1(-)基因型在肺癌组和对照组的分布频率分别为56.6%和57.0%,两组之间无统计学差别(χ2=0.831,P=0.362)。经性别、年龄、吸烟状况调整后分析,携带GSTM1(-)基因型个体未增加患肺癌危险性(OR=0.840,95%CI:0.578-1.221,P=0.362)。②按病理分层分析GSTM1基因型与肺癌各病理类型之间的关系,其中鳞癌、腺癌、小细胞肺癌与其它病理类型肺癌患者GSTM1(-)基因型分布频率分别为65.8%、48.5%、47.8%和52.2%,与对照组相比,不同病理类型患者肺癌危险性均无明显统计学差异(P>0.05)。结论在天津地区人群中GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间无相关性。

犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒N基因序列的保守区域,设计合成特异性引物,制备标准质粒,通过优化实时荧光定量PCR反应条件建立标准曲线,进行灵敏度、组内组间重复性、特异性试验。结果表明,该方法最低检出限度为2.77个拷贝,重复性、特异性良好,说明所建立的荧光定量PCR方法能够快速准确完成犬瘟热病毒检测。

实时荧光定量PCR技术的操作实践

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。

猪流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为研究猪流感病毒(SIV)感染后SIV在体内的分布规律,本研究设计针对SIV NP基因保守区引物,建立了SIV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法对SIV核酸检测灵敏度为30TCID50,对健康猪肺组织cDNA、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)核酸呈阴性反应。采用建立的荧光定量RT-PCR方法对人工感染A/swine/Shanghai/1/2007/H1N2(Sw/SH/1/2007)猪进行检测,结果显示:病毒在猪鼻腔粘膜持续存在至感染后第8d;肛门拭子在感染后2d～8d可持续检测到病毒核酸;喉头、气管在感染后第3d可检到病毒核酸,并持续至第10d;肺部淋巴结、脾脏在感染后5d～7d检测到病毒核酸阳性;其它脏器均未检测到病毒核酸,从而确定呼吸道系统及脾脏是SIV定殖的主要场所,SIV感染猪后向外排毒周期约为1周。

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIMEPCR分析

以甘蓝型油菜陇油2号子叶为转化受体材料,通过农杆菌介导将半夏凝集素抗虫基因(pta)导入陇油2号,经常规PCR检测获得阳性植株3株。以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pep)作为内参基因、选pta全长序列中高度保守区域中145bp的pta2为目的片段对转基因植株进行REAL-TIMEPCR分析,初步证明外源pta基因已整合到油菜细胞基因组中。

人类Gfi1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础。方法以Gfi1基因为靶基因设计引物。构建携带Gfi1cDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品。应用ABI stepone PCR仪对Gfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线。结果建立了Gfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数γ2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%。结论本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测。

PD-L1基因实时荧光定量RT-PCR法的建立及在大鼠肝移植中的应用

目的建立real-time R T-qPCR(实时荧光定量R T-PCR)检测大鼠PD-L1的方法,应用该方法检测大鼠移植肝中PD-L1 mR NA的水平。方法两袖套法复制大鼠肝移植耐受组(BN→BN)及排斥组(LEW→BN)模型,术后7 d处死受体,检测肝功能ALT和AST水平,HE染色病理分析排斥程度,Trizol法提取移植肝总RNA并反转录为cDNA;选β-actin作为内参,复制SYBR GreenⅠreal-time RT-qPCR检测法。利用该方法检测移植肝中PD-L1和β-actin的初始模板量,PD-L1/β-actin计算PD-L1 mRNA的相对表达量。结果异基因LEW→BN组出现急性排斥反应,ALT、AST排斥组均高于耐受组(均P<0.05)。RAI评分排斥组高于耐受组(均P<0.05)。PD-L1扩增效率为98.8%,相关系数为0.996;溶解曲线为特异单峰;变异系数小于2.0%;移植肝中PD-L1 mRNA相对表达为耐受组([0.95±0.10)×10-2]高于排斥组([0.81±0.09)×10-2],差异有统计学意义(t=2.62,P=0.026)。结论成功建立了大鼠源PD-L1的real-time R T-qPCR检测方法,耐受组PD-L1的高表达提示其可能有利于大鼠移植肝的存活,为研究肝移植免疫耐受奠定了理论基础。

四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析

目的比较几种核酸染料(Genefinder、Geneview、SYBER greenI)对于琼脂糖凝胶中DNA/RNA的染色效果并分析其取代溴化乙锭(EB)用于常规电泳后凝胶中核酸染色的可能性。方法分别使用四种核酸染料对凝胶中的RNA/DNA进行染色并对结果进行比较分析。结果四种染料对RNA/DNA染色结果无明显差异(P>0.05)。结论新型核酸染料Genefinder、Geneview和SYBER greenI能够代替EB,用于常规凝胶中的DNA/RNA染色。

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。

条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建

以管家基因18S rRNA为内参,采用SYBR GreenI荧光染料法,构建了条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR的检测方法,为条斑紫菜HSP90和18S rRNA基因筛选出定量引物各1对,获得的扩增曲线基线平整、指数区明显、斜率大且固定。两基因的熔解曲线显示单特异峰,Tm分别为88.5和85℃。两基因标准曲线的斜率分别为-3.307和-3.308,扩增效率都约为100.6%,Ct值在13～32范围内有良好的线性关系。构建的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,准确可靠、重复性好,检测周期短,为进一步研究HSP90基因在胁迫下的表达差异奠定了基础。

nklin大肠杆菌ompT基因的相对表达定量PCR方法的建立

目的建立ompT基因表达水平解析的定量方法。方法利用嵌合荧光（SYBR GreenI）标记，以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立用于ompT基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR。通过大肠杆菌的鸡体内感染模型，获取感染菌体，利用该定量PCR对感染菌体中ompT基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析。结果成功建立了ompT基因表达水平解析的定量PCR。定量PCR结果显示，相对于体外培养，APECE058株ompT在鸡体内的表达上调了6．69倍。结论建立的ompT基因定量PCR方法稳定、可靠，可用于ompT表达水平的解析。

土壤细菌荧光原位杂交对比染色技术的构建

荧光原位杂交技术(FISH)已经成为研究海洋、湖泊及河流沉积物微生物特征的重要手段,但对土壤的应用尚存在局限性。研究以土壤和堆肥为材料,筛选了FISH对比染色荧光剂,并对其染色条件进行了分析。研究结果表明,1/200稀释SYBR Green(ISGI)可用于FISH的对比染色。其染色时间为1 min,封片试剂为无荧光浸镜油。

建立紫花苜蓿PHYA和PHYB mRNA表达水平FQ-PCR检测方法

紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)体系,本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA,PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段,将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBR Green I双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法,对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性,经测序鉴定目的片段已插入pMD18-T载体内,重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性,我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量,结果证明:所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确,适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

实时荧光定量RT-PCR检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达及其意义

目的:建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达并探讨其临床意义。方法:在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)、56例AML初治患者的骨髓ACDA抗凝标本和30例健康体检者的外周血EDTA抗凝标本以及6例细胞形态学正常的骨髓ACDA抗凝标本中的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算其相对表达量。结果:①BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)均存在表达,其中U937表达最高,而HL-60表达最低。②与对照组相比,BMI-1 mRNA在白血病细胞中的表达显著升高(P<0.01)。结论:①SYBR GreenⅠ实时RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测BMI-1 mRNA的方法。②BMI-1参与白血病的发生,可能是一种新的肿瘤分子标记物。

一种新的引物二聚体形成机制

目的 通过SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR无模板测试技术,阐明引物二聚体形成的机制,解决PCR反应中引物二聚体形成的问题,推动SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术的应用.方法采用 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术检测不同特点的典型引物对形成引物二聚体的Ct值,检测特异的反义核苷酸、短寡核苷酸对二聚体的影响,测试优化方案在HBV DNA定量检测中的效果.结果 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR测试发现,3′端连续6～7碱基反向互补的引物对的Ct值：5.0、10.0、11.0;与另一引物中部连续6个碱基反向互补的Ct值：30.0、28.0、29.5;与另一引物5′末端连续6个碱基反向互补的引物对的Ct值：32.0、29.5、31.0.普通引物对测试的Ct值：27.5、29.0、31.0;中间部分同向相同的引物对测试的Ct值：36.5、43.0、39.0;同向相同的引物对未形成二聚体,反向相同引物对测试Ct值是30.5.低温预处理的短寡核苷酸促进二聚体形成,而在热启动PCR反应中无作用,特异的反义核酸抑制二聚体.PCR增效剂推后普通引物对的二聚体1个循环,推后部分同向相同的引物对的二聚体10个循环.中间部分相同的引物对检测低浓度质粒标准品比普通引物对检测结果更精确.结论 提出一种新的引物二聚体形成机制：引物对在3′末端碱基反向互补结合的基础上,借助剩余序列的同向互补力量拉近彼此在空间上的距离,从而进行延伸反应形成引物二聚体.中间偏3′端同向相同的引物对可以有效抑制引物二聚体,并且该作用可以被其他优化方法加强.

寄主因素对白虫小茧蜂产卵的影响

在实验室观察了白虫小茧蜂的产卵行为,从化学及物理的角度探讨了寄主因素对白虫小茧蜂产卵的影响。这些寄主因素包括寻主利它素、寄主表皮的化学物质,显微结构和柔软性。实验表明:寄主表皮的柔软性是影响该小茧蜂产卵的关键因素。寻主利它素、寄主表皮的化学物质和结构均对产卵没有影响。

白虫小茧蜂的离体培养

白虫小茧蜂Bracon greeni Ashmead是紫胶白虫的重要天敌。本文首次报道用人工培养基成功地使白虫小茧蜂从卵离体培养至成虫。所用培养基的成分为昆虫血淋巴、鸡蛋黄和牛奶液。每100ml培养基含庆大霉素4—6万单位。培养基用帕拉玢膜(parafilm)加工成“模拟寄主”。幼虫存活率、化蛹率和成虫羽化率分别为85—91％、70—71％和67—69％。卵期20—22小时,幼虫期历时3—4天,预蛹和蛹期历时7—8天,一个发育周期需11—13天。成虫体长雌3.2—4.5mm,雄2.5—4.0mm,雌雄比约1:3。和用天然寄主白虫来繁殖的白虫小茧蜂相比,发育速度大体上相当,体型稍大,雌性比低。成虫能交配产卵,并在大蜡螟幼虫和模拟寄主上繁育出雌雄后代。但成本有待降低,所用离体培养技术也有待改进。

基于遥感的康巴什生态环境质量评价研究

生态环境是人类文明存在和发展的基础,生态环境质量评价可为深入了解现代城市对环境的影响提供重要的信息。康巴什是全国首个以城市景观命名的4A级旅游景区,其环境评价尤为重要。本文以鄂尔多斯市康巴什为研究对象,利用Sentinel-2A和Landsat8OLI影像对康巴什地区环境变化进行研究,通过分析绿度指标、湿度指标、温度指标和干度指标来构建RSEI指数评价生态环境,可以直观的反应地区生态环境质量的变化,为城市绿化建设提供数据参考。

基于RED-X的新能源汽车充电故障应用探究

国家大力推进新能源汽车的发展与推广,作为新产品新技术,新能源汽车给主机厂带来了不同于传统车的品质缺陷。Red X工具是分析系统和统计工程的方法,通过分析极端样件差异找到复杂问题产生的根本原因。本文以运用RED-X工具解决新能源汽车充电故障为例,通过运用问题定义树、项目定义树、元件查找、分组对比等几个Red X策略步骤的研究分析,找到了问题的根源,希望能给解决新能源汽车的其他问题提供参考。

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR GreenI实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法。方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101~108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%。熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃。结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法。