实时荧光定量PCR技术的操作实践

采用Mx3000P型实时荧光定量PCR仪,以SYBRGreen I法相对定量技术为例,设计1例检测针对HIV-1 vpr基因的特异性siRNA基因沉默效果的实验。介绍了实时荧光定量PCR技术上机前样本的制备过程、检测程序及相关参数的设置方法等操作流程;结合熔解曲线、扩增曲线进行结果分析;强调了实验整体设计、引物设计与PCR反应体系的优化和内参的恰当选择在实时荧光定量PCR技术中的重要性。

应用SYBR greenI荧光PCR研究GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间的相关性

背景与目的谷胱甘肽S转移酶M1(glutathione S-transferase M1,GSTM1)基因是参与体内多种致癌物代谢的重要的II相代谢酶,其基因多态性被认为与人肺癌遗传易感性有关。本研究旨在探讨天津地区汉族人群GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间的关系。方法采用SYBR green I实时荧光PCR熔解曲线分析方法检测天津地区265例肺癌患者和307例对照者GSTM1基因多态性,应用病例对照研究分析其与肺癌易感性及不同病理类型之间的关系。结果①GSTM1(-)基因型在肺癌组和对照组的分布频率分别为56.6%和57.0%,两组之间无统计学差别(χ2=0.831,P=0.362)。经性别、年龄、吸烟状况调整后分析,携带GSTM1(-)基因型个体未增加患肺癌危险性(OR=0.840,95%CI:0.578-1.221,P=0.362)。②按病理分层分析GSTM1基因型与肺癌各病理类型之间的关系,其中鳞癌、腺癌、小细胞肺癌与其它病理类型肺癌患者GSTM1(-)基因型分布频率分别为65.8%、48.5%、47.8%和52.2%,与对照组相比,不同病理类型患者肺癌危险性均无明显统计学差异(P>0.05)。结论在天津地区人群中GSTM1基因多态性与肺癌遗传易感性之间无相关性。

猪流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为研究猪流感病毒(SIV)感染后SIV在体内的分布规律,本研究设计针对SIV NP基因保守区引物,建立了SIV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法对SIV核酸检测灵敏度为30TCID50,对健康猪肺组织cDNA、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)核酸呈阴性反应。采用建立的荧光定量RT-PCR方法对人工感染A/swine/Shanghai/1/2007/H1N2(Sw/SH/1/2007)猪进行检测,结果显示:病毒在猪鼻腔粘膜持续存在至感染后第8d;肛门拭子在感染后2d～8d可持续检测到病毒核酸;喉头、气管在感染后第3d可检到病毒核酸,并持续至第10d;肺部淋巴结、脾脏在感染后5d～7d检测到病毒核酸阳性;其它脏器均未检测到病毒核酸,从而确定呼吸道系统及脾脏是SIV定殖的主要场所,SIV感染猪后向外排毒周期约为1周。

半夏凝集素基因对油菜的遗传转化及REAL-TIMEPCR分析

以甘蓝型油菜陇油2号子叶为转化受体材料,通过农杆菌介导将半夏凝集素抗虫基因(pta)导入陇油2号,经常规PCR检测获得阳性植株3株。以油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(pep)作为内参基因、选pta全长序列中高度保守区域中145bp的pta2为目的片段对转基因植株进行REAL-TIMEPCR分析,初步证明外源pta基因已整合到油菜细胞基因组中。

PD-L1基因实时荧光定量RT-PCR法的建立及在大鼠肝移植中的应用

目的建立real-time R T-qPCR(实时荧光定量R T-PCR)检测大鼠PD-L1的方法,应用该方法检测大鼠移植肝中PD-L1 mR NA的水平。方法两袖套法复制大鼠肝移植耐受组(BN→BN)及排斥组(LEW→BN)模型,术后7 d处死受体,检测肝功能ALT和AST水平,HE染色病理分析排斥程度,Trizol法提取移植肝总RNA并反转录为cDNA;选β-actin作为内参,复制SYBR GreenⅠreal-time RT-qPCR检测法。利用该方法检测移植肝中PD-L1和β-actin的初始模板量,PD-L1/β-actin计算PD-L1 mRNA的相对表达量。结果异基因LEW→BN组出现急性排斥反应,ALT、AST排斥组均高于耐受组(均P<0.05)。RAI评分排斥组高于耐受组(均P<0.05)。PD-L1扩增效率为98.8%,相关系数为0.996;溶解曲线为特异单峰;变异系数小于2.0%;移植肝中PD-L1 mRNA相对表达为耐受组([0.95±0.10)×10-2]高于排斥组([0.81±0.09)×10-2],差异有统计学意义(t=2.62,P=0.026)。结论成功建立了大鼠源PD-L1的real-time R T-qPCR检测方法,耐受组PD-L1的高表达提示其可能有利于大鼠移植肝的存活,为研究肝移植免疫耐受奠定了理论基础。

人类Gfi1基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立测定人类Gfi1mRNA表达量的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,为进一步研究新基因的功能奠定基础。方法以Gfi1基因为靶基因设计引物。构建携带Gfi1cDNA的质粒plox-Gfi1,经过纯化,质粒浓度测定,拷贝数的计算及10倍的梯度稀释制备标准品。应用ABI stepone PCR仪对Gfi1mRNA进行实时荧光定量PCR检测,建立标准曲线和熔解曲线。结果建立了Gfi1mRNA表达的实时荧光定量PCR方法,本法线性范围为6.36×102～6.36×108copies/μl,线性相关系数γ2为0.996,熔解曲线为单峰,Tm值为(89.98±0.22)℃,标准品的循环阈值批内变异系数和批间变异系数分别为1.35%～3.61%和1.49%～3.42%。结论本研究建立的Gfi1mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法速度快,灵敏度高,特异性强,重复性及稳定性好,可用于Gfi1基因的定量检测。

四种核酸荧光染料在琼脂糖凝胶中染色特性的比较分析

目的比较几种核酸染料(Genefinder、Geneview、SYBER greenI)对于琼脂糖凝胶中DNA/RNA的染色效果并分析其取代溴化乙锭(EB)用于常规电泳后凝胶中核酸染色的可能性。方法分别使用四种核酸染料对凝胶中的RNA/DNA进行染色并对结果进行比较分析。结果四种染料对RNA/DNA染色结果无明显差异(P>0.05)。结论新型核酸染料Genefinder、Geneview和SYBER greenI能够代替EB,用于常规凝胶中的DNA/RNA染色。

人线粒体DNA荧光定量PCR检测方法的建立

建立SYBR Green I实时荧光PCR定量检测人线粒体DNA的方法。选取人线粒体DNA高度保守基因片段,将该基因片段与pCF-T载体连接后,转化入E.coli DH5α,提取重组质粒PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR-Green I荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线。结果表明:构建的标准曲线线性关系良好(反应体系中含101~108拷贝时,扩增反应CT值与拷贝数的对数成线性关系),相关系数为0.997。批内和批间重复性测定的变异系数分别为1.23%~3.29%以及3.10%~5.21%。我们成功建立了实时荧光定量PCR检测人线粒体DNA的方法,该方法可作为进一步研究线粒体DNA的方法,在相关疾病诊断和监测中具有一定的应用前景。

条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建

以管家基因18S rRNA为内参,采用SYBR GreenI荧光染料法,构建了条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR的检测方法,为条斑紫菜HSP90和18S rRNA基因筛选出定量引物各1对,获得的扩增曲线基线平整、指数区明显、斜率大且固定。两基因的熔解曲线显示单特异峰,Tm分别为88.5和85℃。两基因标准曲线的斜率分别为-3.307和-3.308,扩增效率都约为100.6%,Ct值在13～32范围内有良好的线性关系。构建的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强,准确可靠、重复性好,检测周期短,为进一步研究HSP90基因在胁迫下的表达差异奠定了基础。

nklin大肠杆菌ompT基因的相对表达定量PCR方法的建立

目的建立ompT基因表达水平解析的定量方法。方法利用嵌合荧光（SYBR GreenI）标记，以编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的看家基因gapA为内参基因，建立用于ompT基因表达水平解析的两步法实时定量反转录PCR。通过大肠杆菌的鸡体内感染模型，获取感染菌体，利用该定量PCR对感染菌体中ompT基因在感染鸡体内的表达水平进行了解析。结果成功建立了ompT基因表达水平解析的定量PCR。定量PCR结果显示，相对于体外培养，APECE058株ompT在鸡体内的表达上调了6．69倍。结论建立的ompT基因定量PCR方法稳定、可靠，可用于ompT表达水平的解析。

土壤细菌荧光原位杂交对比染色技术的构建

荧光原位杂交技术(FISH)已经成为研究海洋、湖泊及河流沉积物微生物特征的重要手段,但对土壤的应用尚存在局限性。研究以土壤和堆肥为材料,筛选了FISH对比染色荧光剂,并对其染色条件进行了分析。研究结果表明,1/200稀释SYBR Green(ISGI)可用于FISH的对比染色。其染色时间为1 min,封片试剂为无荧光浸镜油。

建立紫花苜蓿PHYA和PHYB mRNA表达水平FQ-PCR检测方法

紫花苜蓿的秋眠与光敏色素基因的表达紧密相关。为了建立一种快速、灵敏检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应(FQ-PCR)体系,本研究提取紫花苜蓿叶片总RNA,PCR扩增Actin、PHYA和PHYB基因片段,将其克隆入pMD18-T载体进行测序。基于SYBR Green I双链嵌合染料建立检测紫花苜蓿PHYA和PHYB基因mRNA表达水平方法,对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性,经测序鉴定目的片段已插入pMD18-T载体内,重组质粒的构建非常成功。为验证其准确性,我们检测紫花苜蓿WL-232 PHYA、PHYB mRNA表达量,结果证明:所建立的测定PHYA和PHYB基因mRNA水平的方法准确,适用于紫花苜蓿的各种组织的大量样本检测。

基于RED-X的新能源汽车充电故障应用探究

国家大力推进新能源汽车的发展与推广,作为新产品新技术,新能源汽车给主机厂带来了不同于传统车的品质缺陷。Red X工具是分析系统和统计工程的方法,通过分析极端样件差异找到复杂问题产生的根本原因。本文以运用RED-X工具解决新能源汽车充电故障为例,通过运用问题定义树、项目定义树、元件查找、分组对比等几个Red X策略步骤的研究分析,找到了问题的根源,希望能给解决新能源汽车的其他问题提供参考。

实时荧光定量RT-PCR检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达及其意义

目的:建立SYBR GreenⅠ实时定量RT-PCR方法检测白血病细胞中BMI-1 mRNA的表达并探讨其临床意义。方法:在TRIzol提取总RNA后,将mRNA逆转录成cDNA,再用SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法检测BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)、56例AML初治患者的骨髓ACDA抗凝标本和30例健康体检者的外周血EDTA抗凝标本以及6例细胞形态学正常的骨髓ACDA抗凝标本中的表达,扩增产物的特异性通过熔解曲线和凝胶电泳双重确认,以ABL为内参照,采用2-△△ct法计算其相对表达量。结果:①BMI-1 mRNA在白血病细胞系(K562、HL-60、Daudi、Jurkat、Molt-4、U937和THP-1)均存在表达,其中U937表达最高,而HL-60表达最低。②与对照组相比,BMI-1 mRNA在白血病细胞中的表达显著升高(P<0.01)。结论:①SYBR GreenⅠ实时RT-PCR是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测BMI-1 mRNA的方法。②BMI-1参与白血病的发生,可能是一种新的肿瘤分子标记物。

犬瘟热病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒N基因序列的保守区域,设计合成特异性引物,制备标准质粒,通过优化实时荧光定量PCR反应条件建立标准曲线,进行灵敏度、组内组间重复性、特异性试验。结果表明,该方法最低检出限度为2.77个拷贝,重复性、特异性良好,说明所建立的荧光定量PCR方法能够快速准确完成犬瘟热病毒检测。

实时荧光定量PCR检测人类EZH2基因方法的建立

目的:建立SYBR GreenI实时荧光PCR定量检测人类EZH2基因的方法。方法:将EZH2 RT-PCR扩增片段克隆入载体pGEM-T后,经测序鉴定正确后,进行纯化和定量及系列稀释,应用SYBR GreenI实时荧光定量PCR检测EZH2,建立标准曲线,熔解曲线分析产物的特异性。结果:该法检测的最低拷贝数为10,线性范围为101~108拷贝,相关系数r为-1.00,104copies/μl标本的批内变异系数(CV)和日间CV分别为1.0%和2.7%。熔解曲线分析显示单一的峰,熔解温度(Tm)为(83.42±0.13)℃。结论:实时荧光定量PCR方法检测EZH2基因,具有高敏感性、高特异性和高精确性等优点,可作为进一步研究EZH2的方法。

检测鼻气管鸟疫杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法的建立

利用DNAStar对GenBank上发布的鼻气管鸟杆菌(ORT)16S rRNA基因进行序列分析,根据分析结果选择其保守区域设计1对特异性的引物。扩增16SRNA部分保守基因序列并将其克隆至pMD18-T载体,构建重组质粒,经鉴定、纯化后作为阳性标准品,用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线的建立。反应条件反复优化后,成功建立了检测ORT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。该方法对ORT的最低检测量约为100拷贝数/μL,比普通PCR高100倍;与引起禽类呼吸系统疾病的其他病原体之间无交叉反应;批内和批间试验的变异系数均小于0.63%,充分显示该方法具有良好的重复性和稳定性。对46份临床样本进行ORT检测,该方法检测的阳性样本为38份,检出率为82.26%。在38份阳性样品中,普通PCR只检出30份阳性样品,常规细菌培养只检出23份阳性样品。结果表明:本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法比其他方法更敏感,为临床上快速准确的检测、诊断禽类ORT的感染提供了敏感可靠的检测方法。