灰树花多糖纳米乳的制备及其对H9亚型禽流感病毒与常见细菌抑制效果的评估

为制备灰树花多糖(GFP)纳米乳,并观察其理化及形态学特征,评估其对H9亚型禽流感病毒(AIV)及3种常见细菌的抑制效果,本研究采用低能乳化法制备GFP纳米乳,经不同方式处理后观察GFP纳米乳的稳定性,分别采用透射电镜和扫描电镜观察其形态特征,使用激光粒度仪测定GFP纳米乳的粒径与多分散系数(PDI),使用电位仪测定其Zeta电位。结果显示:该GFP纳米乳外观澄清、透明,8000 r/min离心20 min和室温静止7 d后不分层、不破乳,表明制备的GFP纳米乳性状稳定。电镜观察可见许多单一分布的均匀圆球,其周围包裹着网格状凝胶基质;GFP纳米乳的粒径为10 nm~100 nm,平均粒径24.12 nm,PDI为0.096,Zeta电位为-18.6±4.3 m V,表明GFP纳米乳稳定性较好。将不同浓度的GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂分别于MDCK细胞中与H9亚型AIV NJ02株作用,通过计算各药物对H9亚型AIV的抑制率比较GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制效果。将不同稀释度的GFP纳米乳、GFP溶液及免手洗凝胶和75%乙醇分别与AIV NJ02株作用后,采用荧光定量PCR(q PCR)检测H9亚型AIV基因的拷贝数,并计算各药物对H9亚型AIV的抑制率。采用药敏纸片法检测GFP纳米乳、GFP原液、免手洗凝胶对禽舍3种常见细菌的抑菌效果。对H9亚型AIV的抑制率检测结果显示,当浓度低于10μL/mL时,GFP纳米乳及免手洗凝胶消毒剂对H9亚型AIV的抑制率均小于55%,效果不明显;当浓度大于40μL/mL时,GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率极显著高于同浓度的免手洗凝胶(P<0.01);当浓度为80μL/mL时,GFP纳米乳可以100%抑制病毒增殖,且对细胞无毒性。qPCR结果显示,10倍稀释的各药物对H9亚型AIV的抑制率均明显高于100倍稀释的各药物,且10倍稀释的GFP纳米乳对H9亚型AIV的抑制率均极显著高于免手洗凝胶、GFP原液和75%乙醇(P<0.01)。纸片扩散法结果显示,GFP纳米乳对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差,对枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的抑菌效果较强,但总体GFP纳米乳的抑菌效果比免手洗凝胶稍差。上述结果表明,本研究制备的GFP纳米乳性状稳定,对体外培养的H9亚型AIV具有良好的抑制效果,对禽舍常见细菌具有一定的抑制效果,且安全无毒副作用,有望作为安全高效的纳米消毒剂用于畜禽和人类的消毒。本研究为开发新型抗病毒中草药纳米消毒剂奠定了实验基础。

响应曲面法优化灰树花水溶性多糖提取工艺的研究

在单因素试验的基础上,利用响应曲面法对灰树花多糖提取工艺参数进行优化研究。响应面分析结果表明,提取温度、提取时间以及水料比与响应值灰树花多糖得率存在显著的相关性,通过典型性分析得到优化灰树花多糖提取条件:提取温度为89.7℃;时间2.48h;以及水料比31.1:1,提取两次,在此条件下灰树花多糖提取得理论值达到10.62%,验证试验条件下实际最大多糖得率为(10.13±0.7)%。

灰树花多糖的超滤分离及免疫活性研究

目的:从灰树花子实体中提取分离灰树花多糖并进行免疫活性检测。方法:热水和稀碱提取灰树花子实体多糖后,利用乙醇沉淀法和超滤法获取灰树花水溶性及碱溶性子实体多糖,通过小鼠脾淋巴细胞转化增殖实验检测免疫活性。结果:利用乙醇沉淀法获得水溶性及碱溶性多糖两个组分,得率分别为6.67%和5.88%,利用超滤法获得分子量范围分别为大于1000kD、100～1000kD以及10～100kD的共六个灰树花子实体多糖组分,其中水溶性多糖组分GFP100、GFP10和GFP1的得率分别为3.99%、0.51%和3.94%,碱溶性多糖组分GFAP100、GFAP10和GFAP1的得率分别为2.42%、2.32%和3.04%,利用超滤法获得的六个多糖组分均显示了显著的促进小鼠脾淋巴细胞转化增殖作用。结论:超滤法应用于灰树花子实体多糖的分离要优于传统乙醇沉淀法,该法工艺简便,多糖得率更高,且不损害其活性。

灰树花多糖的分离纯化及体外抗肝癌作用研究

利用超声破碎、水提醇沉、葡聚糖凝胶过滤层析等方法,对灰树花子实体多糖进行分离得到多糖组分GFD-1。高效液相色谱分析表明,GFD-1是分子量为29.574 k Da的多糖均一组分。利用显色试验、紫外光谱、红外光谱及原子力显微镜分析,GFD-1为不含还原性羰基、酚羟基、游离或结合蛋白质、核酸类物质的非淀粉类α-吡喃多糖,其糖链高度在0.5 nm^1 nm。GFD-1能够显著抑制人肝癌细胞HepG2的增殖,并呈剂量依赖关系,IC_(50)为94μg/m L,但其对于正常肝脏细胞L-02无明显影响;通过AO/EB双染,经GFD-1作用的HepG2细胞呈典型凋亡形态学特征;经流式细胞仪分析,HepG2细胞被阻遏在S期。上述结果可知,初步确定分离纯化的GFD-1是一种具有抗肿瘤活性的均一多糖组分,为开发天然抗肿瘤物质和进一步分析其抗肿瘤作用机制提供了参考。

灰树花子实体多糖的降血糖活性和对α-葡萄糖苷酶活性的影响

研究灰树花子实体多糖MT-α-glucan对自发性2型糖尿病模型KKay小鼠降血糖作用的量效关系和时效关系,对KKay小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量、糖原合成的影响,以及对α-葡萄糖苷酶活性的影响。结果表明:随着MT-α-glucan给予剂量的增加,降血糖作用逐渐增强,以112、225、450mg/kgbw剂量组降血糖作用较为明显;MT-α-glucan 450mg/kgbw单次给予后8h降血糖作用最为明显,随后血糖水平逐渐恢复,给予后24h恢复到给予前水平。MT-α-glucan(450、150mg/kgbw)多次给予具有降低KKay小鼠空腹血糖、提高口服葡萄糖耐量、促进糖原合成的作用,并可使小鼠24h内随机血糖维持在较低的稳定水平。而且,MT-α-glucan对α-葡萄糖苷酶活性具有较强的抑制作用。因此,MT-α-glucan具有明显的降血糖活性,作用机理与抑制α-葡萄糖苷酶活性有关。

灰树花胞外多糖特性研究进展

灰树花是一种珍贵的药、食两用蕈菌,灰树花多糖是其主要的活性成分,具有增强免疫功能、抗肿瘤、抗HIV等广泛的生物活性。本文对灰树花胞外多糖的结构、分离纯化和生物活性进行了综述,分析了国内外当前的研究现状,对灰树花胞外多糖的研究做了展望。旨在为灰树花胞外多糖的深入研究和开发利用提供参考。

灰树花胞外多糖发酵条件优化研究

灰树花是一种营养丰富的药食两用真菌,其胞外多糖是一种具有抑制肿瘤、抗HIV、调节免疫等生理活性的真菌多糖。研究了碳源、氮源、生长促进剂和无机盐对灰树花产胞外多糖的影响,结果表明,灰树花产胞外多糖较佳的培养基组合为每升培养基添加葡萄糖50 g、黄豆粉40 g、豆油1 g、KH2PO4 4 g、MgSO4 2 g,每升培养基可得到灰树花胞外多糖3.78 g。

采用动态热回流法制备莲花菌多糖

以莲花菌子实体为材料,采用动态热回流法制备莲花菌多糖。通过单因素试验和正交试验研究原料颗粒粒径、提取温度、溶液pH、液料比、溶剂回流率、提取时间对莲花菌多糖提取效果的影响,并将动态热回流法与传统热水浸提法进行比较。研究结果表明:动态热回流法制备莲花菌多糖的最佳工艺条件是:原料颗粒粉碎度为3 500μm,提取温度为95℃,溶液pH为6.5,液料比为6.5-1.0,溶剂回流率为15%,提取时间为90 min,在此条件下,粗多糖得率可以达到13.98%,比传统热水浸提法提高16.1%,提取时间比传统法减少了3/4,溶剂用量比传统法减少了7/8。该方法可用于莲花菌多糖的规模化制备生产,亦可为其他真菌多糖及相关产品的大规模工业生产提供借鉴。

灰树花菌丝体发酵酒工艺研究

以灰树花菌丝体发酵液为原料研制灰树花菌丝体发酵酒,在单因素实验研究的基础上,采用L9(34)正交实验设计对其发酵工艺条件进行了优化。结果表明,酒精发酵的优化工艺为酵母菌接种量1.0 g/L、发酵温度22℃、初始pH4,适宜的澄清方法为超滤澄清,澄清度达到78.7%,得到的灰树花菌丝体发酵酒产品色泽浅黄,澄清透明无明显杂质,口感柔和醇厚,酒精度11.75%vol,灰树花多糖含量1.56 g/L。

灰树花多糖对糖尿病小鼠的降血糖作用

目的:观察灰树花多糖(GFP)对糖尿病小鼠(DM)的血糖调节作用。方法:将四氧嘧啶按180 mg/kg b.wt.剂量腹腔内1次性注射制作糖尿病小鼠模型。实验组分别按750、250、125mg/kg b.wt.三个剂量每天灌服GFP,正常对照组和实验对照组每日灌服相应体积的水,实验周期均为40 d。尾静脉采血测小鼠血糖值及糖耐量实验。结果:喂养40 d后,250 mg/kg.b.wt.剂量组与实验对照组比较,血糖水平和血糖曲线下面积均明显降低(P<0.05),750和125 mg/kg b.wt.剂量组与实验对照组比较无明显降低(P>0.05)。结论:灰树花多糖具有降低实验性糖尿病小鼠血糖的作用。

不同产地灰树花多糖含量测定

目的测定不同产地灰树花多糖含量，为灰树花多糖的综合开发利用提供科学依据。方法采用蒽酮-硫酸法，正交试验确定最佳工艺，测定不同产地灰树花粗多糖、可溶性糖含量。结果18批不同产地灰树花粗多糖含量8．17％～34．82％，可溶性糖含量27．46％～55．65％。结论不同产地灰树花多糖含量具有显著差异。

灰树花子实体多糖中β-葡萄糖含量的酶法测定

目的探讨灰树花子实体多糖中β-葡聚糖含量的测定方法。方法多糖粗提物依次用高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶和α-1，4葡萄糖水解酶水解，通过测定其中葡萄糖的含量计算β-葡聚糖的含量。结果确定了测定方法中几种酶的用量。在0～300mg·L^-1范围内线性关系良好，测得灰树花子实体多糖中β-葡聚糖含量为3．26％～3．51％，3组样品的平均回收率为90．5％。结论该方法操作简便，准确度高。

灰树花多糖复合酶协同微波辅助提取工艺及抗氧化性研究

以灰树花干物质为原料,通过响应面Box-Behnken法优化复合酶协同微波辅助提取多糖工艺,采用sevage法去蛋白、001×7大孔树脂脱色,并对DEAE-52纤维素层析柱分离的组分进行抗氧化性研究。响应面试验结果显示,灰树花多糖最佳提取工艺条件为:在微波时间7 min、料水比1∶27(g/mL)、酶配比1∶1(质量比)、酶料比0.02 g/g条件下,灰树花多糖提取量为73.25 mg/g,与预测值的相对偏差为3.17%。采用纯水和0.05 mol/L NaCl对DEAE-52纤维素层析柱进行洗脱得到两种灰树花多糖(Grifola frondosa polysaccharide,GFP)GFP1、GFP2。体外抗氧化试验表明:GFP1、GFP2浓度为6 mg/mL时,还原力达到0.43和0.48;对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基清除率最高分别为33.54%和50.38%、对羟自由基清除率最高分别为81.59%和90.21%、对超氧阴离子自由基清除率最高分别为79.23%和87.23%,GFP2相较GFP1具有更好的抗氧化能力。

灰树花子实体多糖的结构特性分析及提高小鼠的运动耐力

探究灰树花子实体多糖(GFP)的结构特性,同时考察其对小鼠运动耐力的影响,为后续灰树花多糖的深入研究提供参考。通过超声波、水提醇沉法获得灰树花粗多糖,采用DE-52纤维素柱和Sephadex G-100进行分离纯化,在扫描电镜下观察多糖的形貌特征,高效凝胶渗透色谱分析多糖的分子量,红外光谱分析多糖糖苷键构型,高效液相色谱测定多糖的单糖组成。构建小鼠力竭游泳和转棒疲劳实验模型,通过测定小鼠体内肝糖原(Hepatic Glycogen,HG)、肌糖原(Muscle Glycogen,MG)及血清生化指标,考察多糖对小鼠运动耐力的作用。结果表明,GFP纯化后分离得到3个多糖组分,GFP-A1的占比最大,得率为62.98%,其重均分子量为18374 u,异头碳为α构型,由鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、岩藻糖组成,摩尔比为1:10.52:11.38:18.67。小鼠的动物实验结果显示,与CK组相比,GFP-A1低、中、高剂量组的小鼠力竭游泳时间和转棒疲劳时间均显著提高(P<0.05),HG、MG含量和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性同样显著增加(P<0.05),血乳酸(Blood Lactic Acid,BLA)、血尿素氮(Blood Urea Ntrogen,BUN)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量则显著降低(P<0.05),表明GFP-A1可以显著提高小鼠的运动耐力,且呈剂量依赖关系。结果表明,从灰树花子实体中提取的GFP-A1具有明显提高小鼠运动耐力的作用,该研究为灰树花多糖在运动食品领域上的开发应用提供了理论依据,具有广阔的应用前景。

多糖、粗蛋白含量高的灰树花菌株筛选

为满足灰树花栽培与加工需求,提供特定优良灰树花菌株,本试验将收集的13个灰树花菌株进行人工栽培、摇瓶发酵培养,通过比较不同菌株子实体间、菌丝体间胞内多糖和粗蛋白含量,筛选出G5、G6菌株胞内多糖含量高,G5菌株适宜子实体提取胞内多糖,G6菌株适宜液体发酵菌丝体提取胞内多糖;G6、G7菌株粗蛋白含量高,G7菌株适宜子实体提取粗蛋白,G6菌株适宜液体发酵菌丝体提取粗蛋白。

Immunomodulatory activity of macromolecular polysaccharide isolated from Grifola frondosa

The present study was designed to evaluate the immune-modulating effects of the polysaccharide from Grifola frondosa(GFP) by using mouse peritoneal macrophage and cytoxan(CTX) induced immunosuppression models. Our results from the phagocytotic and mononuclear phagocytic system function assays showed that GFP-A(one component from GFP) stimulated the phagocytosis of the phagocytes. The splenocyte proliferation assay showed that GFP-A acted the effect combing Con A or LPS in splenocyte proliferation. The results showed that GFP-A increased indices of thymus and spleen, the levels of LDH and ACP in the spleen, the m RNA levels of IL-1β, IL-2, IL-6 and IFN-γ in splenocyte. And GFP-A also significantly increased the expression of CD4^+ and CD8^+ splenic T lymphocytes, which were suppressed by the CTX in peripheral blood. In conclusion, our results indicate that the GFP-A is involved in immunomodulatory effects leading to its modulatory effects on immunosuppression.

灰树花发酵产β-葡萄糖苷酶和胞内多糖培养基及条件优化

对灰树花液体深层发酵产β-葡萄糖苷酶和胞内多糖的培养基组成和发酵条件进行优化。通过单因素试验确定最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为麸皮。采用响应面中心组合试验设计,同时建立产酶活力和胞内多糖随葡萄糖和麸皮含量变化的二次回归方程,得到灰树花发酵最优培养基组成(g/L):葡萄糖27.83,麸皮35.57,KH_2PO_43,MgSO_4 1.5,VB_1 0.05,在此条件下生物量、胞内多糖含量及β-葡萄糖苷酶活力分别达到1.397 g/100m L,2.176 g/L和22.177 U/100 mL,比优化前分别提高1.9,0.75倍和2.71倍。研究灰树花液体发酵培养过程中初始pH、接种量、温度、转速、接种种龄和发酵时间等发酵条件对产酶活力和胞内多糖产量的影响,结果表明,灰树花发酵的最适初始pH为5.0,接种量10%,选取培养7 d的种子液,25℃,180 r/min振荡培养7 d即可结束发酵。

灰树花多糖的分离纯化及其体外抗肿瘤活性

探究低温提取的灰树花多糖的结构及其体外抗肿瘤活性。利用低温(4℃)水提醇沉法提取灰树花粗多糖,采用Sevage法除去粗糖中的蛋白,透析除去盐类、寡糖等小分子物质,得到多糖组分命名为GFP,其得率为2.13%;离子色谱检测其主要单糖为葡萄糖、半乳糖和甘露糖;高效液相色谱分析结果表明GFP为混合物,含有两个主要的大分子群体,分子量分别为1700.00 ku和34.12ku,其组分峰面积分别为66.57%和28.23%;红外光谱显示GFP可能为α-吡喃多糖。GFP的抗肿瘤活性研究表明:在一定的浓度范围内,GFP能显著抑制人肝癌HepG2细胞的增殖;通过JC-1染色检测线粒体膜电势的变化发现GFP会引起线粒体膜电位降低,这说明GFP诱导的细胞凋亡伴随着膜电位的改变;经过GFP处理的HepG2细胞出现了典型的细胞凋亡的形态变化,细胞收缩,形成微核。以上均说明GFP诱导HepG2细胞凋亡。

BP神经网络结合遗传算法优化灰树花多糖提取工艺

目的通过BP神经网络结合遗传算法,对灰树花多糖提取工艺进行优化,以探讨最佳提取工艺。方法采用水提醇沉法,以多糖提取率为检测指标,采用3因素(提取温度、提取时间、液料比)4水平正交试验对多糖提取工艺进行考察。用BP神经网络模型结合遗传算法对试验结果进行目标寻优,并通过正交分析法进行验证,获得灰树花多糖的最佳提取工艺。结果 BP神经网络结合遗传算法处理分析得到优化结果为提取温度79.6℃,提取时间3.4 h,液料比50∶1,此方法下多糖提取率为6.754%。结论 BP神经网络结合遗传算法优化灰树花多糖提取工艺的方法有效可靠,可为同类提取工艺的优化提供新思路。