草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

子宫内膜癌组织中IGF2BP1mRNA,PEG10mRNA表达及与增殖基因表达的相关性和预后研究

目的研究子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)组织中胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(insulinlike growth factor 2 mRNA binding protein 1,IGF2BP1)mRNA,父系表达遗传印记基因10(patrilineal expression of genetic imprinting gene 10,PEG10)mRNA表达及与增殖基因表达的相关性及预后。方法选取2017年1月~2019年1月湖北理工学院附属妇幼保健院诊治的100例EC患者。实时荧光定量PCR检测EC癌组织和癌旁组织中IGF2BP1 mRNA,PEG10 mRNA及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)mRNA,细胞周期素D1(cyclin D1)mRNA,细胞周期蛋白依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4,CDK4)mRNA表达。免疫组织化学检测IGF2BP1,PEG10蛋白表达。相关性采用Pearson相关分析。Kaplan-Meier曲线分析不同IGF2BP1,PEG10表达组EC患者的预后差异。COX回归分析EC患者的预后影响因素。结果EC癌组织中IGF2BP1 mRNA(1.84±0.33),PEG10 mRNA(2.12±0.40),PCNA mRNA(3.14±0.42),cyclinD1 mRNA(2.81±0.36),CDK4 mRNA(2.37±0.34)高于癌旁组织(0.78±0.21,0.91±0.25,0.74±0.13,0.67±0.21,0.59±0.18),差异具有统计学意义(t=25.652~54.588,均P<0.05)。癌组织中IGF2BP1(70.00%),PEG10(72.00%)蛋白阳性率高于癌旁组织(100%,9.00%),差异具有统计学意义(χ^(2)=75.000,82.363,均P<0.05)。EC中IGF2BP1 mRNA,PEG10 mRNA表达与PCNA mRNA,cyclinD1 mRNA,CDK4 mRNA表达呈正相关(r=0.562~0.625,均P<0.05)。EC中IGF2BP1 mRNA与PEG10 mRNA表达呈显著正相关(r=0.663,P<0.05)。FIGO分期Ⅲ期、并发淋巴结转移EC癌组织中IGF2BP1(86.49%,87.50%),PEG10(89.19%,90.63%)阳性率高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期(60.32%,61.90%)、无淋巴结转移(61.77%,63.24%),差异具有统计学意义(χ^(2)=6.863~8.608,均P<0.05)。IGF2BP1阳性组患者三年总体生存率70.00%(49/70)低于阴性组的90.00%(27/30);PEG10阳性组患者三年总体生存率为69.44%(50/72),低于阴性组的92.86%(26/28),差异具有统计学意义(Log-rankχ^(2)=4.133,5.491,P=0.042,0.019)。FIGO分期Ⅲ期(OR=1.449,95%CI:1.148~1.830)、并发淋巴结转移(OR=1.442,95%CI:1.124~1.850),IGF2BP1阳性(OR=1.637,95%CI:1.239~2.163)及PEG10阳性(OR=1.576,95%CI:1.136~1.187)是影响EC患者生存预后的独立危险因素(均P<0.05)。结论EC中IGF2BP1,PEG10表达升高,两者与增殖基因表达呈正相关,是EC预后评估的肿瘤标志物。

血清IGFBP-7、IGF-1和sST-2水平预测射血分数保留心力衰竭预后的临床意义

目的:观察血清胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)和可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST-2)水平预测射血分数保留心力衰竭(HFpEF)1年内发生主要不良心血管事件(MACE)的效能。方法:选择2017年1月至2019年12月在我院诊治的HFpEF患者119例,为HFpEF组;选择同期在我院健康体检者45例,为对照组。采用酶联免疫吸附法检测各组患者血清IGFBP-7、IGF-1和sST-2水平。比较HFpEF组和对照组患者血清IGFBP-7、IGF-1、sST-2水平和左室射血分数(LVEF)的变化,观察血清IGFBP-7、IGF-1和sST-2水平与HFpEF患者心功能分级和左室舒张功能减退的关系,及其预测1年内发生MACE的灵敏度和特异性。结果:HFpEF组患者的血清IGFBP-7和sST-2水平高于对照组(P<0.01),血清IGF-1水平低于对照组(P<0.01),两组患者的LVEF水平差异无统计学意义(P>0.05)。血清IGFBP-7和sST-2水平随着HFpEF患者心功能分级和左室舒张功能障碍严重程度的升高而升高(P<0.01),预后不良组患者血清IGFBP-7和sST-2水平高于预后良好组(P<0.01);血清IGF-1水平随着心功能分级和左室舒张功能障碍严重程度的升高而降低(P<0.01),预后不良组患者血清IGF-1水平低于预后良好组(P<0.01)。血清IGFBP-7、IGF-1和sST-2水平预测1年内出现MACE具有较高的诊断效能,联合检测(IGFBP-7+IGF-1+sST-2)的灵敏度为89.2%,特异度为97.6,AUC为0.981,明显高于单个指标IGFBP-7(Z=2.928,P=0.003)、IGF-1(Z=4.060,P<0.001)和sST-2(Z=3.219,P=0.001),而各单个指标之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血清IGFBP-7、IGF-1和sST-2水平参与了HFpEF疾病的发生发展,在预测1年内发生MACE方面具有重要临床价值。

人生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1基因重组慢病毒RNA干扰载体的构建及鉴定

目的 探讨构建人类生长因子受体结合蛋白2相关的接头蛋白1（Gab1）基因重组慢病毒RNA干扰载体的方法,研究其对人脐静脉血管内皮细胞株EA.hy926的沉默效率.方法 针对人类Gab1基因设计5个靶点的小干扰RNA （siRNA）序列,并分别合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经Hpa I和Xho I限制性内切酶双酶切后的GV118载体连接,产生Gab1-RNA干扰（RNAi）转化子,聚合酶链反应（PCR）筛选阳性克隆并进行测序鉴定.将测序正确的Gab1-RNAi、pHelper 1.0和pHelper 2.0质粒共转染239T细胞,包装产生LV-Gab1-RNAi慢病毒并测定其滴度.将获得的慢病毒分别转染EA.hy926细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达,测定其转染效率;通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测转染后的EA.hy926细胞中Gab1 mRNA表达水平来验证慢病毒干扰载体的基因沉默效率.结果 经PCR分析和测序证实,成功构建LV-Gab1-RNAi慢病毒载体;病毒滴度为3×10^9 TU/ml;荧光显微镜下转染组细胞GFP荧光表达强烈,转染效率达70％以上;RT-PCR证实干扰组细胞Gab1 mRNA表达水平（0.088 ±0.003）较对照（0.947±0.087）组和空白组（0.999±0.067）显著降低（P＜0.01）.结论 成功构建人Gab1基因RNAi慢病毒载体并能在293T细胞中扩增获得足够的病毒滴度,能明显抑制Gab1基因在EA.hy926细胞株中的表达.

RNA干扰技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1基因抑制血管生成

目的 探讨应用RNA干扰（RNAi）技术沉默生长因子结合蛋白2相耦联的接头蛋白1（Gab1）基因,使其在体外抑制血管生成.方法 观察人主动脉血管内皮细胞株（EA.hy926）的生长及形态;构建靶向Gab1的小干扰RNA（siRNA-Gab1）表达慢病毒转染EA.hy926细胞;通过Western blot和反转录-聚合酶连反应（RT-PCR）分别检测Gab1蛋白及Gab1 mRNA的表达水平,采用表面培养法构建体外血管生成三维培养模型,观察转染后EA.hy926细胞体外形成血管样结构的数目和长度.结果 与空白组及阴性对照组比较,siRNA-Gab1干扰组EA.hy926细胞形态变化明显,由长梭形逐渐变成星形或多角形;siRNA-Gab1干扰组Gab1蛋白及Gab1 mRNA（0.291 ±0.004）的表达水平明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;siRNA-Gab1干扰组三维培养模型中血管样结构的数量（15.600±2.608）个和长度（2.896 00 ±0.736 97） mm均明显减少;其差异有统计学意义（P＜0.05）.而阴性和空白对照组之间比较,细胞形态均呈梭形,Gab1蛋白及Gab1 mRNA（1.001±0.050、1.063 ±0.040）的表达水平、三维培养模型中血管样结构的数量（35.800±2.775）、（38.200±2.588）个和长度（6.3000±0.912 8）、（6.466±1.2529） mm差异均无统计学意义（P＞0.05）.结论 siRNA-Gab1能够抑制EA.hy926细胞中Gab1的mRNA及其蛋白的表达,从而在体外抑制血管生成.