Correlation between the Polymorphism of PPARγ-2 gene and the Susceptibility of Type 2 Diabetes Mellitus in Guangxi Bama Mini-pigs

[ Objective] The research aimed to discuss the relationship between the polymorphism of PPARy.2 gene and the susceptibility of type 2 diabetes mellitus （T2DM） in Guangxi Bama mini-pigs. [ Method] 24 Guangxi Bama mini-pigs were fed with high-fat and high-sucrose diet, and partial sequences of exon 2 of PPARy-2 gene were amplified by using PCR method. In addition, the contents of fasting blood glucose and insulin （INS） in Guangxi Bama mini-pigs were determined, and the glucose tolerance test （GTT） was also carried out. [ Result] There was one SNP site （19813A/G） Jn partial sequence of exon 2 of the cloned PPAFly-2 gene, and AA （7 pigs） and AG （17 pigs） genotype were detected. The contents of fasting insulin and 60-min blood glucose in GTT in AG-genotype Guangxi Bama mini-pigs were significantly higher than those of AA genotype （ P 〈0.05）, while the incidence of T2DM in AG-genotype Guangxi Bama mini-pigs （71.4%） was obviously higher than that of AA gen- otype （5.9%）. [ Conclusion] The polymorphism of 19813A/G in exon 2 of PPARy-2 gene was related with the susceptibility of T2DM in Guangxi Bama mini-pigs.

广西巴马小型猪克隆胚的构建及胚胎移植

通过胚胎移植验证构建的广西巴马小型猪克隆胚是否可以发育到期。利用刺入式手术胚胎移植法,将0.5～1.5日龄巴马小型猪克隆胚移植到2头巴马小型猪和2头陆川猪的输卵管壶腹部。其中2头巴马小型猪和1头陆川猪返情,另外一头陆川猪于2007年10月13日产下1头克隆雄性巴马小型猪。说明巴马小型猪克隆胚能够在受体猪体内发育到期并产仔。

广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型的制作

本试验旨在制作广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型,初步判断猪发生动脉粥样硬化时的指数值,以期为今后建立相关模型提供依据。试验选取广西巴马小型猪试验组和对照组各10头,通过饲喂高脂高胆固醇饲料建立动脉粥样硬化模型,检测建模过程中血液生化指标,将动脉粥样硬化指数与血管切片作关联分析,初步拟定发生动脉粥样硬化时的指数值。屠宰后血管切片结果显示,试验组有2头广西巴马小型猪发生动脉粥样硬化,对照组均正常。2头广西巴马小型猪的血管切片结果与动脉粥样硬化指数进行关联分析后,初步拟定的动脉粥样硬化指数值在3.8以上,并持续3个月以上。

广西巴马小型猪肥胖基因(leptin)成熟肽序列的cDNA克隆、序列分析

以广西巴马小型猪的脂肪组织总RNA为模板,通过RT-PCR扩增出巴马小型猪的leptin基因成熟肽序列,经纯化回收后连接到pMD18-T载体上,经鉴定后测序。研究结果表明,本试验克隆到leptin基因成熟肽cDNA序列,其长度为441 bp,与GenBank中报道的猪leptin成熟肽cDNA序列同源性高达99.06%,与奶牛、家鼠、马等物种的成熟肽cDNA序列间同源性可达到84.5%以上,证明leptin基因具有较高的保守性。同时发现,与普通猪相比,巴马小型猪leptin基因成熟肽cDNA序列有四处存在碱基突变,均为无义突变。

广西巴马小型猪ApoE基因真核表达载体的构建及鉴定

【目的】构建广西巴马小型猪载脂蛋白E基因(ApoE)真核表达载体,为生产转ApoE基因的广西巴马小型猪奠定基础。【方法】采用RT-PCR从广西巴马小型猪肝组织中扩增出ApoE基因编码序列,将该基因连接至pEGFP-C1载体上,利用双酶切和测序对重组质粒pEGFP-C1-ApoE进行鉴定,并将重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞。【结果】广西巴马小型猪ApoE基因编码区序列长954bp,编码317个氨基酸,与GenBank已公布的猪ApoE基因cDNA序列(NM_214308)对应区段同源性为100%。构建的重组质粒pEGFP-C1-ApoE转染PK15细胞48h后,在荧光显微镜下转染细胞发出荧光,细胞形态清晰,可见细胞核。【结论】广西巴马小型猪ApoE基因能与pEGFP-C1载体重组构建pEGFP-C1-ApoE真核表达载体,有效表达出ApoE蛋白。

广西巴马小型猪Tau基因可变剪接体的克隆和鉴定

为研究广西巴马小型猪‰基因可变剪接体序列，根据NCBI中预测的猪‰基因序列设计引物，利用巢式PCR和5’RACE方法克隆并验证‰基因。结果显示：广西巴马小型猪Tan基因与参考序列相比存在3处缺失，分别为191～277、344～1389、1526～1579bp。3处缺失形成4条Tau基因的可变剪接体，其序列长度分别为1302、1215、1356、1269bp，提交至GenBank获得登录号分别为KC473498、KC473499、KC473500、KC473501。

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

【目的】克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础。【方法】利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以p EGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照。【结果】克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与Gen Bank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸。广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%。构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白。【结论】广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究。

广西巴马小型猪MCP-1基因克隆及序列分析

【目的】研究广西巴马小型猪单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)基因CDs区的序列特点,为建立广西巴马小型猪动脉粥样硬化模型及揭示动脉粥样硬化的发生、发展机理提供理论依据。【方法】从广西巴马小型猪动脉血管组织中扩增MCP-1基因CDs区全长序列,与人类及其他易建立动脉粥样硬化模型动物的序列进行比对分析,并预测其蛋白质信号肽位点及结构域。【结果】广西巴马小型猪MCP-1基因CDs区全长300 bp,编码99个氨基酸;与人类MCP-1基因CDs区(S71513.1)的同源性最高,为84.4%。广西巴马小型猪MCP-1蛋白的前23位氨基酸为信号肽,后76位氨基酸为成熟肽,等电点(pI)9.51,蛋白质分子量10976.04kDa,信号肽位置有一段跨膜结构;广西巴马小型猪与人类MCP-1蛋白在形成二级结构时,保守半胱氨酸参与形成二硫键的位置一致,分别在第11、12、36和52号(除信号肽片段)位上排列为Cys-Cys,且是第11号位与第36号位形成二硫键,第12号位与第52号位形成二硫键。【结论】以广西巴马小型猪构建动脉粥样硬化模型时,MCP-1基因表达量可作为判断动脉血管疾病的一个辅助指标。

广西巴马小型猪MyoG基因克隆及外显子3多态性分析

为了解RT-PCR扩增广西巴马小型猪肌细胞生成素(MyoG)cDNA序列,并分析与其他物种间的聚类关系,试验采用PCR-SSCP技术分析广西巴马小型猪、长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因外显子3多态性,根据GenBank中已发表的猪MyoG基因序列设计PCR引物,以广西巴马小型猪肌肉组织总RNA为模板进行RT-PCR,所得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序;从4个猪种的耳组织中分别提取30个个体的基因组DNA,采用PCR的方法扩增出外显子3并进行SSCP分析。结果表明:克隆得到广西巴马小型猪MyoG基因编码区长675 bp,与四川野猪、人、奶牛、小鼠同源序列相似性分别为99.7%、93.8%、91.7%、90.5%,且不同物种间保守性较强;与四川野猪相比,克隆得到的广西巴马小型猪MyoG cDNA序列在第233位点及第642位点上发生基因突变;广西巴马小型猪MyoG基因的基因型只有AA型,而长白猪、杜洛克猪、大约克猪MyoG基因的基因型只有AB型,各群体内无多态性。

广西巴马小型猪脂联素受体1和受体2cDNA的克隆及序列分析

[目的]克隆并分析广西巴马小型猪脂联素受体1(AdipoR1)和脂联素受体2(AdipoR2)编码基因的cDNA全序列。[方法]利用RT-PCR法,以骨骼肌总RNA为模板,分别扩增AdipoR1和AdipoR2全长cDNA序列,纯化后连接pMD 18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序,并与其他物种AdipoR1和AdipoR2 cDNA序列进行同源性比较。[结果]RT-PCR扩增得到大小与AdipoR1和AdipoR2基因编码序列大小相同的片段,片段长度为1 128和1 161 bp。同源性比较分析发现,广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素受体同源性分别高达99.8%、99.7%,分别有1处和3处发生了碱基错义突变。[结论]该试验成功克隆了广西巴马小型猪AdipoR1和AdipoR2基因的cDNA,为进一步研究AdipoR基因的生物功能及设计以AdipoR为靶标的新型药物奠定了基础。

广西巴马小型猪PGC-1α基因克隆与组织表达分析

目的克隆广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区(CDS)序列,利用RT-PCR和QRT-PCR方法分析PGC-1αmRNA组织表达情况。方法本实验以广西巴马小型猪背最长肌cDNA为模版,PCR扩增PGC-1α基因CDS序列,将其连接至pEASY-T5载体,转染细菌、验证和序列测定;通过RT-PCR半定量和QRT-PCR实时荧光定量检测PGC-1α基因在小型猪多个组织中的表达情况。结果克隆获得广西巴马小型猪PGC-1α基因CDS序列,全长2391 bp,编码796个氨基酸,与参考序列的同源性为99.9%,两处碱基发生同义突变,分别是C-A1105和GA1524;PGC-1α基因在广西巴马小型猪心脏和肾脏中的表达丰度最高,其次是肝脏、皮下脂肪和背最长肌,而在胰腺中未检测到其表达。结论成功克隆了广西巴马小型猪PGC-1α基因编码区序列并进行了多种组织表达分析,为后续研究PGC-1α在小型猪2型糖尿病发生过程中作用途径打下基础。

广西巴马小型猪氟烷基因PCR-RFLP分析

采用PCR-RFLP分析了广西巴马小型猪的氟烷基因类型。结果显示,PCR扩增获得广西巴马小型猪氟烷基因片段长452bp,其碱基序列与GenBank公布的普通猪同源性为99.6%;采用HhaⅠ酶切检测广西巴马小型猪、巴长二元杂猪和长白猪氟烷基因的PCR产物,均产生2条电泳条带,未表现多态性;测序表明广西巴马小型猪氟烷基因第1843位碱基均为C。猪氟烷基因PCR-RFLP分析技术为优质猪的培育提供了理论依据。

广西巴马小型猪的培育

目的以广西巴马香猪作为原始基础群,要培育出体型尽量小、两头乌毛色整齐、繁殖性能好、遗传性稳定、有关生物学特性明确、适于实验应用的小型猪品系。方法①纯繁闭锁繁育;②封闭群(A系)主要采用群内随机交配方式;③近交系(B系)是在第10世代封闭群的基础上开始选择近交家系,采用连续全同胞兄妹高度近交方式;④定向选择;⑤遗传监测;⑥饲养试验;⑦广西地方标准的制定;⑧有关生物学特性的研究;⑨实验应用。结果①1994年鉴定专家将培育的实验小型猪命名为"广西巴马小型猪",至今己有22年培育历史。②至2009年完成了广西巴马小型猪封闭群21世代的培育。③至2009年完成了广西巴马小型猪近交系11世代的培育。④对小体型、两头乌毛色的整齐性、多产性的选择及性格温顺的驯养均有效。⑤19个微卫星座位上平均观察等位基因数:17世代广西巴马小型猪封闭群为3.00个,在21个微卫星座位上近交系7世代平均观测等位基因数为1.9048个、平均有效等位基因数为1.5461个,平均基因纯合率为0.7232。⑥确认在广西巴马小型猪生长期间营养需要:蛋白质水平12%、能量3100kcal/kg、钙0.65%、有效磷0.32%。⑦在对质量控制因素研究的基础上制定出广西地方标准DB45/T546-2008《实验动物小型猪》(发布日期:2008.09.08、实施日期:2008.10.08)。⑧国内多家研究机构的应用表明广西巴马小型猪是应用于心血管病和糖尿病等研究的优秀模型动物。结论成功培育出适于医学、生物学实验应用的、具有独特优异特性的广西巴马小型猪封闭群和近交系。

广西巴马小型猪卵泡抑素的克隆及原核表达

从广西大学巴马小型猪卵巢中提取总RNA,并以其为模板,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR),在合成的特异性引物引导下,扩增获得广西巴马小型猪卵泡抑素(follistatin)cDNA的全序列,长度为1035 bp。将PCR产物克隆到pMD18-T载体后进行序列测定及分析,结果表明:广西巴马小型猪卵泡抑素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪卵泡抑素同源性高达99.4%。同时,将目的基因插入到原核表达载体pET 32a+多克隆位点中,构建了follistatin的原核表达载体,并转化于大肠杆菌BL21。转化菌经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析,结果表明:试验已成功表达了follistatin的融合蛋白(约58.4 ku)。

广西巴马小型猪脂联素cDNA的克隆及序列分析

为了克隆广西巴马小型猪脂联素基因的cDNA全序列及序列分析,试验利用引物悬挂延伸PCR法,以基因组总DNA为模板,先分别扩增得到编码脂联素的第2外显子和第3外显子的序列,再以这2个外显子为模板,进行第2轮PCR,纯化连接pMD 18-T载体后转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆体,鉴定后测序。结果表明:经PCR产物测序证明,得到大小与脂联素基因编码序列大小相同的片段,此片段长度为732 bp;同源性比较分析发现,广西巴马小型猪脂联素cDNA序列与GenBank中已报道的家猪脂联素同源性高达99.7%,有2处发生了碱基错义突变。

广西巴马小型猪PPARγ-2基因多态性与2型糖尿病易感性的相关性

[目的]探讨PPARγ-2基因多态性与广西巴马小型猪2型糖尿病易感性的关系。[方法]利用高糖高脂日粮饲喂24头广西巴马小型猪,利用PCR方法扩增PPARγ-2基因外显子2部分序列,测定其空腹血糖和胰岛素(INS)含量并进行糖耐量试验。[结果]克隆的PPARγ-2基因外显子2部分序列存在1处SNP位点(19813A/G),有AG(7头)和AA(17头)2种基因型。AG型广西巴马小型猪的空腹胰岛素含量和糖耐量试验中60 min血糖值显著高于AA型(P<0.05),而AG型广西巴马小型猪2型糖尿病发生率(71.4%)明显高于AA型(5.9%)。[结论]广西巴马小型猪PPARγ-2基因外显子2的19813A/G多态性与2型糖尿病易感性有关。

广西巴马小型猪成纤维细胞体外培养体系的建立

为建立广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞体外培养体系,以新生巴马小型猪为试验材料,使用微量液体组织块贴壁法原代培养分离几种成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;根据细胞的形态、生长特性等观察其体外生长能力和增殖寿命。结果显示,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞、耳成纤维细胞、睾丸成纤维细胞、肺部成纤维细胞及脾成纤维细胞获得成功分离,体外可以传代和冷冻;冷冻复苏后仍可以正常培养和传代;腹部成纤维细胞免疫荧光检测结果显示波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性。研究成果可为显微操作核移植、手工核移植和转基因相关操作等提供不同类型的供体材料。

广西巴马小型猪体细胞核移植体系的建立

通过建立广西巴马小型猪体细胞核移植培养体系,为后续转基因克隆猪生产及其相关研究提供最佳条件。试验探讨了盲吸法对猪卵母细胞的去核效率;利用分离到的广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,探讨6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)和细胞松弛素B(CB)对其后续胚胎发育的影响;利用分离到的广西巴马小型猪腹部成纤维作供体,探讨其对核移植胚胎的发育效率。结果表明:猪卵母细胞盲吸法去核的效率为73.75%;广西巴马小型猪附睾成纤维细胞作供体构建重构胚胎,6-DMAP和CB对其后续胚胎发育没有显著差异(分裂率和囊胚率分别为:89.89%and 6.74%vs.82.95%and 5.68%,P>0.05);腹部成纤维细胞作供体,重构胚胎的融合率、分裂率和囊胚率分别为55.40%、67.53%和6.49%。采用盲吸法可以对体外成熟猪卵母细胞成功去核,广西巴马小型猪腹部成纤维细胞和附睾成纤维细胞均可作供体成功构建体细胞核移植胚胎,并可以发育到囊胚。

广西巴马小型猪内源性反转录病毒进化年代分析

【目的】确定广西巴马小型猪内源性反转录病毒(PERV-BM)的进化年代。【方法】对先前扩增、测序获得的9个PERV-BM的LTRs,一个PERV-BM全长基因组序列,登录号为HM159246及Gen Bank上发表的所有背景清楚的猪内源性反转录病毒(PERV)的LTRs及env序列进行分析。首先利用DAMBE软件对上述序列比对分析,合并同源性较高的,筛选有差异代表性的核酸序列的数据集。然后利用MEGA5.2软件Neighbor-Joining方法计算PERV-BM遗传进化关系。利用DAMBE软件对上述筛选的序列集进行替换饱和度计算,分析核酸进化速率的稳定性;利用MEGA5.2软件,通过最大相似法对筛选数据制作的遗传进化树进行分子钟行为分析。最后对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析,对符合分子钟行为的LTRs序列,以假设的恒定进化速率计算PERV-BM的进化年代。【结果】经过DAMBE软件分析后,选出80多个Gen Bank上发表的有代表性的env、LTRs序列数据集。对PERV-BM(HM159246)序列全长遗传进化分析显示,PERV-BM与中国的PERV核酸序列EF133960和GU980187,荷兰的AF356697亲缘关系较近,与韩国的HQ540595和美国的AF038600和NC_003059亲缘关系则较远。利用DAMBE软件对筛选数据集替换饱和度检测结果显示,S和V值随PERV序列之间进化分歧的增加呈线性的增加。LTRs序列数据集替换饱和曲线呈线性关系,没有替换饱和现象发生,LTRs的进化随时间持续且稳定。数据集env序列替换饱和曲线不完全呈线性关系,表明env序列集进化速率不稳定。利用MEGA5.2的最大相似法对LTRs和env数据集的进化树进行分子钟行为检测结果显示,LTRs序列集接受分子钟假说,env进化不符合分子钟行为,这和不饱和度检测的结果一致。因此可用LTRs进化的近分子钟行为进行PERV进化年代的计算。利用DAMBE软件对广西封闭群内的广西巴马小型猪3′-LTR序列进行替代饱和度及分子钟分析结果显示,3′-LTR的进化符合分子钟行为可用于进化年代计算。假设以灵长类ERV的积累突变率,每个核苷酸每年的替换率2.3×10-9—5.0×10-9,计算PERV-BM约进化于3.3×106—7.1×106年前。【结论】PERV-BM进化年代与欧洲小型猪PERV进化时间7.6×106年前相近。

广西巴马小型猪小RNA启动子U6和7SK的克隆及功能验证

为了探讨巴马小型猪启动子U6和7SK的功能以及为生产GGTA1基因沉默的广西巴马小型猪奠定基础,文章克隆并分析了siRNA启动子U6和7SK,并分别连接pMD18-shEGFP载体,分别与PEGFP-N1共转猪肾细胞,进行RNAi实验。以pMD18-hU6-shEGFP为阳性对照,无启动子的pMD18-shEGFP载体为阴性对照,单独转染PEGFP-N1为第一组空白对照,以ddH2O替代质粒为第二组空白对照组,验证这两种启动子在猪细胞中的功能。结果表明:广西巴马小型猪RNA聚合酶III型siRNA启动子U6和7SK的序列全长分别为553 bp和437bp。成功构建了pMD18-pU6-shEGFP和pMD18-p7SK-shEGFP干扰载体,转染猪源PK-15细胞,证明U6以及7SK两个启动子具有较高的siRNA表达活性,可以用于α-1,3半乳糖转移酶等猪源基因的沉默实验。