龟鹿二仙胶治疗阿尔茨海默病研究进展及其抗氧化应激的网络药理学分析

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种中枢神经退行性疾病,严重危害人类健康。中医在“肾生髓,脑为髓海”的理论指导下,采用补肾生髓法防治痴呆已经有了数千年的历史。龟鹿二仙胶出自明代王三才的《医便》,是补肾生髓法的代表方,具有增强免疫、抗衰老、益智等药理作用,可改善AD患者症状。文章对龟鹿二仙胶治疗AD相关研究进行综述的同时,从氧化应激角度采用网络药理学及分子对接技术建立龟鹿二仙胶治疗AD的“关键活性成分-核心靶点-重要通路”的网络图,对靶点的基因功能和通路进行富集,从而探讨龟鹿二仙胶干预AD氧化应激可能的作用机制。通过TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库以及Herb数据库以及查阅文献确定龟鹿二仙胶的有效成分及对应靶点,经UnitProt数据库查询对应的基因名称,最终得到龟鹿二仙胶活性成分67种活性成分和相应靶基因79个。从GeneCards数据库中筛选出AD和氧化应激的共同靶点6100个,取交集得到龟鹿二仙胶与疾病共有靶点68个。基于DAVID数据库,进行GO功能分析与KEGG通路富集分析,结果表明,龟鹿二仙胶干预AD氧化应激的机制可能是通过等山柰酚、β-谷甾醇和豆甾醇成分作用于IL6、PPARG、CASP3等靶点,从而影响脂质和动脉粥样硬化、化学致癌作用-受体活化、癌症通路、肿瘤坏死因子信号通路等信号通路发挥作用。

龟鹿二仙胶抵抗化疗小鼠脾T淋巴细胞凋亡的实验研究

目的探讨龟鹿二仙胶对化疗小鼠的抗凋亡作用及作用机理。方法将荷瘤昆明种小鼠72只随机分为环磷酰胺(CTX)加龟鹿二仙胶高、中、低3个剂量组,CTX组,单纯中药组,生理盐水组6组。给药9天后处死小鼠取脾组织,采用流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡;RT-PCR法检测bcl-2、Caspase-3 mRNA的表达。结果CTX组荧光素标记的膜联蛋白阳性(FITC+AnnexinV)/碘化丙啶(PI)染色阴性比例(FITC+/PI-)T细胞较生理盐水组增高,差异有统计学意义(P<0·05);CTX加用龟鹿二仙胶的3个剂量组FITC+/PI-T细胞比例较CTX组明显降低(P<0·05)。CTX组bcl-2 mRNA表达量较生理盐水组减少(P<0·05);CTX加用龟鹿二仙胶的3个剂量组其表达量较CTX组明显升高(P<0·05)。Caspase-3 mRNA表达量CTX组升高(P<0·05);CTX加用龟鹿二仙胶的3个剂量组表达量较CTX组明显减少。结论龟鹿二仙胶能有效抑制化疗小鼠淋巴细胞凋亡。上调bcl-2 mRNA表达、下调Caspase-3 mRNA表达可能是其作用机理之一。

加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对小鼠Lewis肺癌组织、骨髓组织TGF-β_1/Smad信号通路的影响

目的:观察加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对小鼠Lewis肺癌组织、骨髓组织TGF-β_1/Smad信号通路的影响。方法:建立气阴两虚型C57BL/6J小鼠Lewis肺癌模型,随机分为正常对照组、模型组、加味龟鹿二仙胶汤组、顺铂组及顺铂+加味龟鹿二仙胶汤低、中、高剂量组,每组20只,干预21 d。观察小鼠瘤质量、抑瘤率及骨髓有核细胞计数,Western Blot检测各组移植瘤组织及骨髓组织中TGF-β_1、Smad4和Smad7的蛋白表达。结果:药物干预后,与模型组比较,联合组肿瘤质量均显著降低,移植瘤组织中TGF-β_1、Smad4表达显著降低,Smad7表达显著升高,骨髓组织中TGF-β_1、Smad4、Smad7表达均显著降低(P<0.01)。加味龟鹿二仙胶汤组骨髓有核细胞计数显著高于模型组(P<0.01)。结论:加味龟鹿二仙胶汤与顺铂联用可显著抑制肿瘤增长,提高抑瘤率,减轻骨髓抑制。其机制可能是通过调节TGF-β_1/Smad信号通路来实现。

加味龟鹿二仙胶汤对肺癌耐药裸鼠化疗药敏性的改善作用

目的观察加味龟鹿二仙胶汤通过IL-7介导的JAK3/STAT5信号通路对肺癌耐药裸鼠化疗药敏性的影响。方法建立气阴两虚型肺癌耐药裸鼠模型,分为正常对照组(不造模)、模型组(生理盐水)、顺铂组(顺铂)、中药组(加味龟鹿二仙胶汤)、联合组(加味龟鹿二仙胶汤+顺铂),每组10只,分别给予相应药,干预21 d。观察裸鼠一般情况,计算脾脏指数、抑瘤率,流式细胞仪检测CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞,ELISA法检测血清中细胞因子IL-7水平,RT-qPCR检测肿瘤组织中耐药相关基因(P-gp、MRP 1)的表达,Western blot检测肿瘤组织中JAK3/STAT5信号通路的蛋白表达。结果中药组及联合组摄食量增加,精神状态较好,反应灵敏,体质量增加。联合组脾脏指数较模型组和顺铂组升高(P<0.05)。联合组抑瘤率较顺铂组升高(P<0.01),抑瘤率达70.12%。中药组、联合组CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞比例均低于模型组(P<0.01)。模型组IL-7较正常对照组降低(P<0.01);中药组、联合组IL-7较顺铂组升高(P<0.01)。与顺铂组比较,中药组、联合组P-gp、MRP 1基因表达降低(P<0.05,P<0.01),p-JAK3、p-STAT5蛋白表达降低(P<0.01)。结论加味龟鹿二仙胶汤能抑制肿瘤生长,提高脾脏指数,纠正CD4^(+)CD25^(+)Treg细胞比例,解除机体免疫抑制状态,促进机体产生IL-7,调节IL-7介导的JAK3/STAT5信号通路,减少肺癌组织中耐药相关基因的表达,显著提升肺癌耐药裸鼠的免疫功能,从而改善肺癌顺铂化疗耐药。

龟鹿二仙胶汤治疗膝骨性关节炎的临床研究

观察龟鹿二仙胶汤对膝骨性关节炎的临床疗效。选择符合中西医诊断标准的临床患者120例,按就诊顺序随机分为2组,以龟鹿二仙胶汤和壮骨关节丸对照治疗。结果治疗组总有效率为98.3%,对照组为88.3%,治疗组的疼痛缓解、活动范围、步行能力、日常动作等指标明显优于对照组,2组比较有显著性差异(P<0.01)。说明龟鹿二仙胶汤能有效的改善膝骨性关节炎的临床症状。

龟鹿二仙胶通过调控PD-1表达抑制H22荷瘤小鼠肿瘤生长的研究

目的初步探讨龟鹿二仙胶通过降低肿瘤周围T淋巴细胞PD-1表达,抑制T细胞凋亡,从而抑制肿瘤生长的分子机制。方法采用皮下接种H22肝癌细胞株方法建立荷瘤小鼠模型,观察药物干预后各组荷瘤小鼠肿瘤的生长速度,Annexin V/PI双染色法测定小鼠脾脏T淋巴细胞凋亡比例,分离肿瘤浸润性T淋巴细胞,流式细胞检测PD-1阳性细胞的比例。结果 (1)龟鹿二仙胶呈剂量依赖抑制皮下瘤的生长,顺铂组及高、中、低剂量组抑瘤率分别为81.36%、79.64%、48.86%、21.96%;(2)顺铂组及高、中、低剂量组小鼠T淋巴细胞凋亡比例分别为早期(24.37±0.32)%、(5.30±0.21)%、(6.90±0.16)%、(11.93±2.01)%;晚期(8.83±1.23)%、(4.73±0.33)%、(6.40±0.34)%、(7.47±0.54)%,说明与顺铂组比较,龟鹿二仙胶能够抑制小鼠T淋巴细胞凋亡;(3)龟鹿二仙胶高剂量组、中剂量组的PD-1表达阳性细胞比分别为(11.73±0.54)%、(20.00±0.66)%,明显低于生理盐水组(32.57±0.65)%和顺铂组(31.83±0.43)%,说明龟鹿二仙胶能够降低肿瘤浸润T淋巴细胞中PD-1阳性的比例。结论龟鹿二仙胶具有抑制肿瘤生长的作用,其机制可能是通过抑制PD-1表达,减少T淋巴细胞凋亡,增强机体免疫力,从而抑制和杀伤肿瘤细胞得以实现的。

龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的研究进展

传统名方龟鹿二仙胶能温补肝肾、增强精血、活血祛淤,治疗骨质疏松症疗效显著。现对龟鹿二仙胶治疗骨质疏松症的作用机制及临床研究进行概述,为骨质疏松症的治疗提供思路和方法。

基于PERK/eIF2α信号通路探讨龟鹿二仙胶含药血清对脂多糖诱导大鼠退变软骨细胞凋亡的作用机制

目的:观察龟鹿二仙胶含药血清对脂多糖(LPS)诱导的大鼠退变软骨细胞中蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/真核起始因子2α(eIF2α)信号通路相关蛋白表达的影响,探讨龟鹿二仙胶治疗KOA的作用机制。方法:制备龟鹿二仙胶含药血清及空白血清。采用4周龄SD大鼠膝关节软骨提取软骨细胞并进行体外培养,用甲苯胺蓝染色法对软骨细胞进行鉴定。采用CCK-8法筛选最佳含药血清浓度进行后续实验。用10μg/mL LPS诱导F2代软骨细胞复制退变软骨细胞模型,将细胞分为空白组、模型组、龟鹿二仙胶组、PERK抑制剂组,干预24 h后,分别采用CCK-8法检测软骨细胞活性;TUNEL法检测软骨细胞凋亡情况;RT-qPCR法检测软骨细胞PERK、eIF2α、前凋亡基因C/EBP同源蛋白(CHOP)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)mRNA的表达;Western Blot检测软骨细胞p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Bax、活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bcl-2蛋白的表达情况。结果:与空白组比较,模型组软骨细胞活性显著降低(P<0.05),软骨细胞凋亡数增多,PERK、eIF2α、CHOP、Bax、Caspase-3 mRNA及p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达量显著上调(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著下调(P<0.01);与模型组比较,龟鹿二仙胶组和抑制剂组软骨细胞活性显著提升(P<0.05,P<0.01),软骨细胞凋亡数减少,PERK、eIF2α、CHOP、Bax、Caspase-3 mRNA及p-PERK、p-eIF2α、CHOP、Bax、Cleaved-Caspase-3蛋白表达量显著下调(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达显著上调(P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶含药血清能显著改善大鼠退变软骨细胞活性及细胞凋亡情况,其作用机制可能是通过调控PERK/eIF2α信号通路相关蛋白的表达水平,进而发挥了软骨保护作用。

基于网络药理学的龟鹿二仙胶治疗创伤后应激障碍的作用机制研究

该文通过网络药理学的方法预测龟鹿二仙胶治疗创伤后应激障碍(PTSD)的多成分、多靶点、多途径的作用机制。基于TCMSP数据库、BATMAN-TCM数据库、化学专业数据库、DrugBank数据库获取龟鹿二仙胶的活性成分及对应靶点,从OMIM,TTD,DisGeNET数据库获取PTSD的已知治疗靶点,结合STRING数据库构建活性成分-疾病靶点蛋白互作网络,利用Cytoscape 3.6.0软件对该网络进行拓扑参数分析得到关键活性成分及其靶点。对关键靶点进行GO生物学过程分析和KEGG通路分析,通过Cytoscape 3.6.0软件构建龟鹿二仙胶"活性成分-靶点-通路"网络,采用SystemsDock在线分子对接工具进行对接验证。预测结果表明,龟鹿二仙胶共有67个活性成分和420个靶点,PTSD共有206个已知治疗靶点,Cytoscape 3.6.0拓扑参数分析后共有66个靶点,GO生物学过程分析得出58个条目,KEGG通路分析得出22条通路,分子对接结果显示,degree最大的靶点与其对应的活性成分、通路中疾病和药物的共同靶点与其对应的活性成分能有效结合。结果提示,龟鹿二仙胶可能通过调节突触可塑性、抗细胞凋亡、抗炎及促进恐惧记忆消退起到抗PTSD的作用,涉及的通路包括LTP信号通路、PI3K/Akt/mTOR信号通路、TNF信号通路、含血清素的神经突触通路以及多巴胺能神经突触通路等。该研究为进一步阐释龟鹿二仙胶治疗PTSD的药理机制提供了理论依据。

加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对Lewis肺癌小鼠耐药相关基因及IL-7介导的Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的:通过建立气阴两虚型Lewis肺癌小鼠模型,观察加味龟鹿二仙胶汤联合顺铂对Lewis肺癌小鼠免疫功能、耐药相关基因及白细胞介素-7(IL-7)介导的Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的影响,阐明加味龟鹿二仙胶汤的抗癌机制,为其临床应用提供依据。方法:建立气阴两虚型Lewis肺癌小鼠模型,分为正常组(不造模),模型组(等体积生理盐水),顺铂组(顺铂,2 mg·kg^(-1)),中药组(加味龟鹿二仙胶汤,19.63 g·kg^(-1)·d^(-1)),联合组(加味龟鹿二仙胶汤,19.63 g·kg^(-1)·d^(-1)+顺铂,2 mg·kg^(-1)),每组10只,分别给药,干预21 d。观察小鼠一般情况、脏器指数,计算抑瘤率,流式细胞仪检测CD4+CD25+调节性T细胞(CD4+CD25+Treg),酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清中细胞因子水平IL-7,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肿瘤组织中耐药相关基因P-糖蛋白(P-gp),多药耐药相关蛋白1(MRP1)mRNA的表达水平,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测肿瘤组织中Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达。结果:与模型组比较,中药组及联合组摄食量增加,精神状态较好,反应灵敏,体质量增加。与顺铂组比较,联合组胸腺指数、脾脏指数显著升高(P<0.01),联合组抑瘤率明显升高(P<0.01)。与顺铂组比较,中药组、联合组CD4+CD25+Treg/CD4+明显降低(P<0.05,P<0.01),中药组、联合组IL-7水平显著升高(P<0.01)。与顺铂组比较,中药组、联合组P-gp,MRP1 mRNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),中药组、联合组Wnt1,β-catenin蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论:加味龟鹿二仙胶汤与顺铂联用可明显抑制Lewis肺癌小鼠体内肿瘤的生长,其作用机制可能与其能够解除机体免疫抑制状态,促进机体产生IL-7,调节IL-7介导的Wnt/β-catenin信号通路,减少肺癌组织中耐药相关基因的表达有关。

龟鹿二仙胶对糖尿病大鼠生殖损伤的保护作用及机制

目的:探索龟鹿二仙胶改善糖尿病大鼠生殖损伤的疗效及可能作用机制。方法:将53只SD雄鼠随机分成5组,选取其中1组作为正常组,剩余4组合并成造模组用高脂饲料喂养联合30 mg·kg^(-1)链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立糖尿病模型,以连续3次随机血糖均>16.7 mmol·L^(-1)作为纳入糖尿病生殖损伤模型标准。将成模的大鼠按血糖高低随机分成模型组、龟鹿二仙胶组(2 g·kg^(-1))、维生素E组(0.03 g·kg^(-1))、五子衍宗丸组(0.6 g·kg^(-1)),给予相应药物剂量灌胃,每天1次,连续治疗4周,每周测体质量和血糖。4周后取材进行指标检测,苏木素-伊红(HE)染色观察睾丸及附睾组织形态学变化,原位末端标记法(TUNEL)染色观察睾丸细胞凋亡情况;精液分析仪检测精子浓度和精子活力;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)水平;ELISA检测睾丸组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醇(MDA)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测睾丸组织Nrf2、HO-1、Bax、Bcl-2蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组大鼠睾丸组织萎缩,生精小管数量减少,附睾管壁增生,管腔狭窄;精子浓度和活力下降(P<0.01);血清T、FSH和LH水平降低(P<0.01);睾丸中ROS和MDA含量增加(P<0.01),SOD和GSH-Px水平减少(P<0.01);Bax表达增加(P<0.01),Nrf2、HO-1、Bcl-2表达降低(P<0.01)。与模型组比较,龟鹿二仙胶组睾丸及附睾组织病变得到一定改善;精子浓度和活力提升(P<0.05,P<0.01);血清T和LH含量上升(P<0.05,P<0.01),FSH含量差异无统计学意义;睾丸中ROS和MDA含量降低(P<0.01),SOD和GSH-Px水平增加(P<0.01);Bax表达下降(P<0.01),Nrf2、HO-1、Bcl-2表达上升(P<0.05,P<0.01)。结论:龟鹿二仙胶能在一定程度上改善糖尿病大鼠生殖损伤,提升精子质量,其机制可能与改善氧化应激,抗凋亡作用有关。