青海湖湟鱼(Gymnocypris przewalskii)中PCBs和PCDD/Fs的分析

应用同位素稀释高分辨气相色谱/高分辨质谱(HRGC/HRMS)分析了青海湖湟鱼体内多氯联苯(PCBs)和二噁英(PCDD/Fs)的含量.发现7—9年龄段湟鱼体内平均PCBs总浓度高达3484.9pg.g-1ww,PCBs的毒性当量为0.41—0.57 pgWHO-TEQ.g-1ww.除了PCB-81以外,其它11种二噁英类PCB都被检出,7种具有指示作用的PCB同系物(PCB-28,52,101,138,153,180)的浓度含量占总PCBs浓度的26%.湟鱼体内二噁英基本上未检出.由于青海湖区基本上没有工业污染源,鱼体内的PCBs可能是长距离迁移沉降和生物富集的结果.

青海湖裸鲤仔稚鱼耳石结构特征与早期生长相关性分析

为了解青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)仔稚鱼耳石结构特征与其早期生长的相关性,通过采集典型洄游产卵河道的青海湖裸鲤野生仔稚鱼和同期人工培育的仔稚鱼,观察仔稚鱼耳石微结构特征,确认第一轮纹出现时间和耳石轮纹沉积规律,并拟合耳石轮纹数、轮纹间距与日龄间的关系。结果表明:青海湖裸鲤仔稚鱼耳石生长呈日周期性,日龄以轮纹数(N)+1进行推算;根据日龄和采样日期推算,2020年从青海湖支流沙柳河采集的野生仔稚鱼孵化期为6月5日—8月14日,主要集中于7月中旬和8月初,从泉吉河采集的野生仔稚鱼孵化期为6月27日—8月3日,孵化高峰期在7月中旬,与早期野外资源现场调查发现鱼卵的孵化期时间基本吻合;野生与人工培育仔稚鱼全长(LT)与日龄(t)均呈极显著线性相关(P<0.001),耳石长度与仔稚鱼全长呈显著线性相关(P<0.05),其中,15℃条件下人工培育的仔稚鱼相关系数最高,此条件下的人工培育仔稚鱼全长拟合方程为L_(T)=0.1672t+10.377(R^(2)=0.6890,P<0.001)。研究表明,青海湖裸鲤仔稚鱼耳石生长受环境因子影响较大,且耳石的沉积变化与仔稚鱼生长发育关系密切。

青海湖裸鲤自主摄食节律与生长特性研究

为探究盐碱环境中鱼类的摄食和生长特性,为耐盐碱鱼类增殖保护和盐碱水养殖提供基础数据,本研究以青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)为代表,研究其在盐碱水(青海湖湖水)环境中的自主摄食节律,设置自然光照(14L:10D)湖水组和全黑暗(24D)湖水组,以自然光照(14L:10D)淡水组为对照。结果显示,青海湖裸鲤为白昼摄食类型鱼类。在自然光照条件下,淡水环境中,青海湖裸鲤的摄食高峰期为08:00—11:00,摄食低谷期则为05:00—08:00;湖水环境中,青海湖裸鲤在08:00—19:00呈现较高且持续的摄食现象,其平均每小时摄食量显著高于05:00—08:00和19:00—05:00时段。而在全暗环境中,青海湖裸鲤摄食的节律性减弱,各时段的平均每小时摄食量较为接近。经63d的自主摄食养殖,在自然光照下,湖水组的青海湖裸鲤在高盐碱环境中的体长增长率为(1.19±0.17)%、体重增长率为(10.66±0.98)%、特定生长率为(0.16±0.02)%/d,均分别显著低于淡水组青海湖裸鲤的体长增长率[(18.66±0.41)%]、体重增长率[(67.32±3.05)%]和特定生长率[(0.82±0.03)%/d],表明生长受到抑制。湖水组和淡水组青海湖裸鲤的体长–体重关系参数(b)均小于3,表明青海湖裸鲤为负异速生长鱼类,其中,湖水组b值小于淡水组,即湖水组体重增长速率低于淡水组,在一定程度上说明高盐碱环境导致青海湖裸鲤的生长特性发生变化。本研究通过探寻青海湖裸鲤在青海湖水环境以及淡水人工养殖中的摄食节律及生长规律,为青海湖裸鲤人工增殖投喂策略的制定提供理论依据,同时,为盐碱生境中鱼类的摄食习性研究提供基础数据。

青海湖裸鲤肠道菌群对不同盐度胁迫的响应

为了探讨盐度胁迫对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)肠道菌群结构的影响,基于三代全长16S扩增子测序技术,对不同盐度(0、5、10、15)下青海湖裸鲤肠道内容物进行微生物测序及信息分析。结果表明:在门水平上,不同盐度组青海湖裸鲤肠道菌群的相对丰度不同,对照组(盐度0)和低盐度组(盐度5、10)肠道菌群中,相对丰度较高的是梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria),其次是厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes),疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)等也占有一定比例,高盐度组(盐度15)中以变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门和疣微菌门为主要菌群;在属水平上,对照组和低盐度组肠道菌群中鲸杆菌属(Cetobacterium)和气单胞菌属(Aeromonas)相对丰度较高,其次是弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella),高盐度组中以弧菌属、假红杆菌属(Pseudorhodobacter)和卤蕨属(Haloferula)为主要菌群。研究表明,低盐度(盐度≤10)胁迫对青海湖裸鲤肠道菌群结构的影响不大,而高盐度(盐度≥15)胁迫则会抑制青海湖裸鲤肠道菌群和优势菌群的生长且影响较大。

急性低氧胁迫对青海湖裸鲤血液指标和肝脏氧化应激及糖代谢的影响

为探究青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)血液和肝脏组织对急性低氧胁迫的生理响应,将体质量(25.3±3.4)g的1龄青海湖裸鲤放在透明密封的(长33 cm×宽22 cm×高18 cm)水槽中,每槽22尾。急性低氧处理前,水槽持续充氧,水体溶解氧浓度为(8.1±0.2)mg·L^(-1)(对照组)。急性低氧胁迫时,终止充氧,用透明塑料薄膜覆盖水槽上方,水槽内水体溶解氧浓度快速下降(试验组)。当半数青海湖裸鲤出现如行动迟缓、反应迟钝、身体失衡等缺氧症状时[约(43±2)min,溶解氧约为(0.46±0.03)mg·L^(-1)],测定水体溶解氧浓度,同时取样测定青海湖裸鲤血液生理生化指标和肝脏抗氧化及糖代谢相关指标的变化。结果表明,在急性低氧胁迫后,青海湖裸鲤血液生理生化指标均呈现出不同程度的变化趋势。其中Na^(+)、K^(+)、Mg^(2+)、Cl^(-)和尿素氮(BUN)浓度与胁迫前相比无显著差异(P>0.05),Ca^(2+)浓度显著高于胁迫前(P<0.05);血红蛋白(HGB)数量、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、总蛋白(TP)和甘油三酯(TG)含量与胁迫前相比无显著差异(P>0.05);HGB浓度,白细胞(WBC)、中心粒细胞(Gran)、淋巴细胞(Lymph)的数量,葡萄糖(GLU)和肌酐(CREA)浓度,天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性显著高于胁迫前(P<0.05);淀粉酶(AMS)活性较胁迫前显著下降(P<0.05);在急性低氧胁迫后,青海湖裸鲤肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性升高,显著高于对照组(P<0.05),丙二醛(MDA)含量较对照组也有所升高且差异显著(P<0.05);在急性低氧胁迫后,青海湖裸鲤肝脏中磷酸果糖激酶(PFK)活性较胁迫前无显著变化(P>0.05),己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)活性显著升高,与对照组差异显著(P<0.05)。结果表明,青海湖裸鲤在急性低氧胁迫下,通过激活抗氧化系统供能方式倾向糖酵解等降低机体氧化损伤程度。除了影响正常的生理代谢,急性低氧胁迫也一定程度氧化损伤青海湖裸鲤肝脏和肾脏等。

不同盐度胁迫对青海湖裸鲤幼鱼抗氧化和免疫相关酶活性的影响

为探究盐度胁迫对青海湖裸鲤幼鱼组织和血液中非特异性免疫酶活性的影响,采用5‰、10‰、15‰盐度分别胁迫6、12、24、48、72 h后,测定青海湖裸鲤幼鱼鳃、肾脏和肝脏中CAT、SOD、ACP和AKP的酶活性,测定肝脏中GPT和GOT的酶活性及血清中LZM的酶活性。结果表明:经过盐度胁迫后,鳃、肾脏和肝脏中SOD、CAT的酶活性均被激活,且有不同程度的升高;肝脏中ACP及肾脏和肝脏中AKP的酶活性均显著增加;鳃和肾脏中ACP和鳃中AKP的酶活性均未被激活或受到抑制;血清中LZM酶活性的变化趋势各异。各盐度组肝脏中GOT和GPT的酶活性都表现出升高趋势且数倍于对照组,且在不同盐度组中GPT酶活性的增长幅度大于GOT酶活性。研究结果有助于进一步了解在经历盐度突变时青海湖裸鲤幼鱼的应答反应、机体受损程度和免疫状况,从而为提高人工增殖放流在青海湖裸鲤资源恢复中的贡献率提供数据参考。

青海湖裸鲤SMIT1和SMIT2基因克隆及其对碱度环境的应答

【目的】哺乳动物钠/肌醇共转运蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter, SMIT)有2个同源体,分别是SMIT1和SMIT2,属于溶质载体(SLC)超家族。试验旨在探究青海湖裸鲤SMIT1、SMIT2基因对碱度环境的应答,为后续SMIT1和SMIT2基因在碱度环境下参与肌醇转运的分子机制奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增、克隆SMIT1、SMIT2基因CDS区,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术检测SMIT1和SMIT2基因在淡水环境下青海湖裸鲤鳃、肾脏、脑等8个组织中的表达情况,以及不同碱度胁迫(0、J25、J50、J75、J100)下鳃和肾脏组织中2个基因表达的规律;利用气相色谱质谱法(GC-MS)检测不同碱度胁迫下鳃和肾脏组织中的肌醇含量变化。【结果】SMIT1基因CDS区为2 130 bp,共编码709个氨基酸,其氨基酸序列与犀角金线鲃相似性最高(86.5%),与多鳞白甲鱼亲缘关系最近;SMIT2基因CDS区为2 016 bp,共编码671个氨基酸,其氨基酸序列与多鳞白甲鱼的相似性最高(90.3%),与犀角金线鲃、多鳞白甲鱼的亲缘关系较近。SMIT1和SMIT2均属于溶质体超家族的SLC5家族成员,其中SMIT1蛋白包含2个SLC家族保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示,淡水环境下SMIT1和SMIT2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,其中,SMIT1基因在脑和肾脏中表达量较高,SMIT2基因在肾脏中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。随着碱度的升高,与对照组相比,J25、J50、J100时SMIT1基因在青海湖裸鲤鳃中表达量均显著升高(P<0.05),在肾脏中整体表达量均显著升高(P<0.05);J25时SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃中表达量显著升高(P<0.05),J50、J75、J100时在肾脏中表达量均显著降低(P<0.05)。GC-MS结果显示,随着碱度的升高,青海湖裸鲤鳃中肌醇含量均显著高于对照组(P<0.05);肾脏中肌醇含量与对照组相比无显著变化(P>0.05)。【结论】SMIT1、SMIT2基因CDS区分别长2 130和2 016 bp,分别编码709和671个氨基酸,SMIT1基因在青海湖裸鲤脑组织中高表达,而SMIT2基因在青海湖裸鲤肾脏中高表达。不同碱度胁迫下SMIT1、SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃、肾脏中的表达规律不同;肌醇含量在鳃组织中显著升高,且在J50时达到最高,在肾脏中变化不显著。研究结果为进一步探究青海湖裸鲤适应碱度环境的分子机制提供参考依据。

低氧胁迫对青海湖裸鲤端脑抗氧化酶活性、细胞凋亡及相关基因表达的影响

为研究青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)端脑在低氧胁迫下的生理响应机制,选取体重(97.68±0.12)g、体长(24.11±0.12)cm的健康青海湖裸鲤进行低氧[溶解氧含量(0.7±0.1)mg/L]胁迫,设常氧[溶解氧含量(8.4±0.1)mg/L]为对照组,分别在低氧胁迫8h和24h时采集青海湖裸鲤的端脑组织,进行脑细胞线粒体超微结构和膜电位、抗氧化酶活性、脑细胞凋亡和凋亡相关基因(Caspase 3、Bax和Bcl-2)及低氧诱导反应相关基因(Hif-2α和EGLN1)表达测定。结果显示,在低氧胁迫过程中:(1)端脑神经细胞线粒体出现肿胀、嵴溶解;线粒体膜电位在8h时显著升高,24h时显著降低,表明随着低氧胁迫时间的延长端脑神经细胞线粒体可能受到了损伤。(2)TUNEL检测显示端脑细胞发生了凋亡,但随着低氧胁迫时间延长端脑细胞凋亡率无显著差异;qPCR显示,随着低氧胁迫时间的延长端脑细胞Caspase 3、Bax和Bcl-2基因表达水平升高;Bcl-2/Bax比值随低氧胁迫时间的延长显著降低;Hif-2α基因表达水平显著升高;EGLN1基因表达水平显著降低。(3)分光光度法结果显示,端脑细胞过氧化氢(H_(2)O_(2))含量在8h时显著增加,但随着低氧胁迫时间延长H_(2)O_(2)含量无显著差异;超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)在8h时与常氧组无显著差异,24h时显著高于常氧组;谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)组间无显著差异。以上结果提示,低氧胁迫通过促进端脑细胞ROS产生,改变线粒体膜的通透性,上调Caspase 3、Bax和Bcl-2基因表达,导致端脑细胞凋亡。同时,在低氧胁迫下端脑细胞可能通过提高T-AOC和SOD活性及上调Hif-2α基因和下调EGLN1基因表达来减少低氧应激对端脑细胞的损伤。

青海湖裸鲤实时荧光定量PCR内参基因筛选与验证

为探明青海湖裸鲤候选内参基因在低温环境下的表达稳定性,根据RNA-seq定量结果筛选表达稳定的候选内参基因,利用实时荧光定量PCR检测候选基因在0℃和17℃下,脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量,并通过GeNorm、Norm Finder和Best Keeper3种分析程序分析其表达稳定性,筛选出理想的内参基因。结果显示:根据RNA-seq定量结果,共筛选获得脱水酶(Abhd18)基因、微球蛋白(B2m)基因、延伸蛋白A(Eloa)基因、DAZ相关蛋白2(Dazap2)基因、肌动蛋白(Actb)基因、磷酸甘油醛脱氢酶(Gapdh)基因、BCL细胞死亡激动因子(Bad)基因和脂肪酸结合蛋白3(Fabp3)基因等8个候选基因;对上述基因的表达稳定性进行分析,发现表达最稳定的是B2m和Eloa基因,表达最不稳定的是Fabp3基因;利用B2m和Eloa基因作为双内参基因对4个脂肪酸代谢相关基因在0℃和17℃脑、肝胰脏、肌肉组织中的表达量进行校正,其相对表达比值与RNA-seq结果高度正相关。研究结果可为高原鱼类极端环境适应的研究提供候选内参基因。

基于SNP标记的青海湖裸鲤遗传多样性及种群结构研究

为探究青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的种质资源现状,为该物种保护措施的制定提供参考依据。首次利用基因分型技术(Genotyping-by-sequencing,GBS),对青海湖水域的6个地理群体共72尾青海湖裸鲤进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记开发和遗传特征分析。共检测出1600061个SNP位点,质控后筛选出45266个高质量的SNP位点用于遗传分析,发现核苷酸多样性(Pi)为0.3170~0.3274,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)分别为0.4594~0.4823和0.3367~0.3444。6个地理群体的遗传距离(D)为0.0184~0.0233,两两群体的遗传分化系数(Fst)均不显著(P>0.05)。分子方差分析(Analysis of molecular variances,AMOVA)显示102.37%的遗传变异来自群体内;群体遗传结构和系统发育进化树分析均显示6个群体属于一个集群,具有遗传同质性;而主成分判别分析(Discriminant analysis of principal components,DAPC)表明哈尔盖河、黑马河和沙柳河群体相互交叉聚类,其余3个地理群体分别聚类。综上,6个青海湖裸鲤群体的Ho均大于He,种群结构单一。

青海湖入湖河流大型底栖动物时空分布及渔产潜力估算

探究青海湖及其入湖河流底栖动物的群落结构与时空分布,根据底栖动物现存量估算渔产潜力,可为青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的增殖放流和种群持续恢复提供科学依据。以青海湖5条主要入湖河流(黑马河、布哈河、泉吉河、沙柳河、哈尔盖河)为研究对象,于2019年在青海湖裸鲤洄游前期、中期和后期对18个断面进行采样调查。结果表明,调查共记录底栖动物101种(属),隶属于5门7纲9目44科。空间分布上,黑马河种类最多,有56种(属),哈尔盖河最少仅27种(属),且EPT(蜉蝣目、襀翅目和毛翅目)自上游至下游呈减少趋势;密度和生物量均以泉吉河最高(544个/m2,4.77 g/m2),生物多样性各指数以黑马河最高。时间尺度上,青海湖裸鲤洄游前期、中期和后期,大型底栖动物种类数无明显变化,但密度和生物量均呈增加趋势,生物多样性各指数呈降低趋势。影响大型底栖动物密度和生物量分布的主要因素为底质类型、海拔高度、水温、浊度和电导率(P?0.05)。基于大型底栖动物估算的渔产潜力以布哈河最高(285 129 kg),其次是泉吉河(20 694 kg)和沙柳河(18 857 kg),与青海湖裸鲤密度及产卵场空间分布较为一致,这与亲鱼洄游产卵需要大量的食物来源有很大关系。

青海湖裸鲤FXYD基因家族鉴定、分子进化及表达

青海湖裸鲤是唯一一种适应青海湖高盐碱水环境的鲤科鱼类。苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸(FXYD)家族是一类小分子单跨膜蛋白,具有调节离子通道作用,在多种生物的盐度胁迫和盐度适应中发挥重要作用。笔者基于青海湖裸鲤全基因组数据,利用生物信息学方法,鉴定到16个青海湖裸鲤FXYD(gpFXYD)基因,通过多重序列比对和系统进化分析,16个gpFXYD基因成员分属于5个亚型。共线性分析表明,青海湖裸鲤FXYD基因家族中12个成员起源于全基因组复制,且与斑马鱼FXYD基因存在共线性,推测全基因组复制导致了青海湖裸鲤FXYD基因的加倍。分子进化分析显示,gpFXYD1b/1c和gpFXYD5c/5d基因的进化选择压力(Ka/Ks)>1,表明其在进化过程中受到了正选择,可能发生了适应性进化。不同亚家族在青海湖裸鲤多种组织表达中,gpFXYD1s基因在青海湖裸鲤的心脏和脑组织特异性表达,而gpFXYD7s基因在青海湖裸鲤的脑组织中特异表达,分析gpFXYD基因不同亚型可能在不同组织中发挥功能。组织表达中,gpFXYD5s、gpFXYD6s、gpFXYD11s基因在青海湖裸鲤肾脏和鳃组织中出现显著表达变化,表明gpFXYD5s、gpFXYD6s以及gpFXYD11s可能与青海湖裸鲤在高盐度条件下的离子运输和渗透压调节密切相关。试验结果可为解析青海湖裸鲤盐度适应奠定基础,同时也可为水产动物耐盐分子育种提供参考和借鉴。

碱度胁迫对青海湖裸鲤血清生理生化指标的影响

【目的】探究碱度对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)相关生理生化指标的影响,对制定青海湖裸鲤应对碱环境的策略提供理论参考。【方法】以青海湖裸鲤血清为研究对象,进行慢性碱度胁迫,碱度先逐渐上升至最高点后逐渐降低(未胁迫为对照),测定分析取各胁迫点血清中激素、渗透、能量、氧化及免疫等指标的变化。【结果】青海湖裸鲤血清的皮质醇(COR)、钙(Ca^(2+))、血糖(GLU)、渗透压(OS)、Na^(+)/K^(+)-ATPase(NKA)、碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、碳酸酐酶Ⅳ(CAⅣ)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和丙二醛(MDA)变化趋势相同,均为随碱度升高先升高后下降,随碱度降低则先下降后升高。COR与CAIV、总胆固醇(TC)、ALT、GPX和MDA呈极显著正相关(P<0.01),与TP、GLOB、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、TG和CAT呈显著正相关(P<0.05,下同)。胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、超氧化物歧化酶(SOD)、钠(Na^(+))、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)有相同变化趋势,无论碱度升高还是下降,均呈先下降后升高变化趋势。三碘甲状腺原氨酸(T3)、TC、HDL-C和LDL-C与碱度呈负相关,肌酐(CREA)和总胆红素(TBIL)与碱度呈正相关。IGF-Ⅰ与T3呈显著正相关。甲状腺激素(T4)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活力随碱度升高先升高后下降再恢复,之后随碱度降低先下降后升高。生长激素(GH)和氯(Cl-)随碱度升高先升高后下降再升高,之后随碱度降低逐渐升高。催乳素(PRL)含量随碱度升高先稍微下降后恢复再降低,之后随碱度降低先迅速升高后恢复。钾(K^(+))浓度随碱度升高而下降,随碱度降低先升高后下降。尿酸(UA)含量随碱度升高先下降后恢复,随碱度降低逐渐下降。尿素(UREA)含量随碱度升高先升高后恢复再升高,随碱度降低继续升高后恢复。【结论】在碱度胁迫时,青海湖裸鲤COR起主导作用,T3和IGF-Ⅰ协同,T4调控GH辅助,从而维持鱼类的体液稳态;TP、ALB、GLOB和TG含量的升高、SOD活力先下降后恢复及AKP活力先下降后恢复再升高等反应可能是青海湖裸鲤应对碱环境的一个重要策略。

Cu^(2+)、Pb^(2+)对青海湖裸鲤的急性毒性效应及相关基因表达的影响

为了研究Cu^(2+)、Pb^(2+)对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)的急性毒性效应及相关基因相对表达水平的变化,实验以静态暴露和qPCR法分别进行毒性试验及检测青海湖裸鲤鳃、肾脏和肝脏中Nrf2(核因子NF-E2相关因子)、Keap1(Kelch样环氧氟丙烷相关蛋白)、MT(金属硫蛋白)、TNF-α(肿瘤坏死因子α)、Hsp90(热休克蛋白90)、Hsp70(热休克蛋白70)、iNOS(诱导型一氧化氮合酶)和COX-2(环氧化酶2)的相对表达。毒性实验结果表明,Cu^(2+)(0.1、0.2、0.5、1和2 mg/L)对1龄青海湖裸鲤安全浓度为0.03 mg/L;Pb^(2+)(0.5、1、2.5、5和10 mg/L)安全浓度为0.1 mg/L;Cu^(2+)+Pb^(2+)的复合胁迫对青海湖裸鲤具有拮抗作用。在低于安全浓度Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)复合胁迫下,检测基因表达水平结果显示,Nrf2在Cu^(2+)和Pb^(2+)胁迫12 h时表达上调,Keap1在Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)复合胁迫12 h的肾脏中显著下调,表明Nrf2-Keap1两者之间存在负调控作用。各浓度条件下,MT的表达在鳃和肝脏中均下调,TNF-α的表达在鳃中上调。在Cu^(2+)+Pb^(2+)复合条件下,TNF-α的表达显著上调。在Cu^(2+)、Pb^(2+)条件下,Hsp90、Hsp70、iNOS和COX-2的表达量均下调。结果表明,各浓度Cu^(2+)、Pb^(2+)与Cu^(2+)+Pb^(2+)对青海湖裸鲤均产生毒性影响,各基因均对低浓度重金属离子作用产生应答。

青海湖裸鲤和花斑裸鲤线粒体基因组比较及其系统进化分析

为正确区分青海湖裸鲤和花斑裸鲤,向科学研究及偷捕鱼货物的司法鉴定提供相应的数据支撑。对青海湖裸鲤和花斑裸鲤的线粒体基因组进行测序和生物信息学分析。此外,基于36种鲤科鱼类的线粒体全基因组序列用最大似然法(ML)构建鲤科鱼类系统发育树。结果表明,青海湖裸鲤线粒体基因组全序列全长为16 720 bp,包括13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1个D-Loop控制区,整个青海湖裸鲤线粒体基因组的核苷酸组成为28.68%A、27.29%T、18.16%G及25.87%C,AT偏向性显著(55.97%)。花斑裸鲤线粒体基因组全序列全长为16 760 bp,包括13个蛋白编码基因,22个tRNA基因,2个rRNA基因和1个D-Loop控制区,整个花斑裸鲤线粒体基因组的核苷酸组成为28.63%A、27.22%T、18.26%G及25.88%C,同样具有明显的AT偏向性(55.85%)。青海湖裸鲤和花斑裸鲤线粒体基因组所有蛋白编码基因以ATG作为起始密码子,绝大多数蛋白编码基因以TAG或TAA作为终止密码子,少数以不完全密码子(T--)作为终止密码子,所有的tRNA基因均能形成典型的三叶草结构。系统发育分析结果显示,裸鲤属所有物种都聚为一个类群,并与光倒刺鲃、大理裂腹鱼和扁吻鱼的亲缘关系较近。该研究基于线粒体基因组的系统发育分析未将青海湖裸鲤和花斑裸鲤准确区分,但为重新建立更清晰的鲤科鱼类分类体系奠定了基础。

青海湖裸鲤TNNI1和TNNI2基因克隆及其响应盐碱胁迫的表达研究

【目的】克隆青海湖裸鲤慢收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI1)和快收缩骨骼肌型肌钙蛋白I基因(TNNI2),分析其在不同组织及盐碱胁迫环境下皮肤和腹侧肌肉组织中的表达水平,为揭示青海湖裸鲤生长缓慢及恢复青海湖裸鲤鱼类资源提供基础数据。【方法】以青藏高原特有鱼类青海湖裸鲤为研究材料,利用RACE技术克隆TNNI1和TNNI2基因全长cDNA序列,进行氨基酸序列同源性比对;利用实时荧光定量PCR法检测2个基因在青海湖裸鲤鳃、眼、脑、脾脏、肝脏、肠、肾、心、皮肤、腹侧肌肉组织的表达情况,以及盐碱胁迫下腹侧肌肉和皮肤组织中的表达规律。【结果】青海湖裸鲤TNNI1 cDNA序列全长为1211 bp,其中开放阅读框540 bp,共编码179个氨基酸;TNNI2 cDNA序列全长为737 bp,其中开放阅读框531 bp,共编码176个氨基酸。序列同源性分析发现,青海湖裸鲤TNNI1氨基酸序列与安水金线鲃的同源性高达92.13%,TNNI2氨基酸序列与鲤鱼的同源性最高为92.61%。系统发育树结果显示,从TNNI1氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与金线鲃属鱼类、鲫鱼、鲤鱼的亲缘关系较近;从TNNI2氨基酸序列来看,青海湖裸鲤与鲤鱼的亲缘关系最近,其次是鲫鱼和金线鲃属鱼类。TNNI1和TNNI2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,且在腹侧肌肉中相对表达量最高。盐碱胁迫条件下,TNNI1和TNNI2基因在肌肉组织中的相对表达量均显著下调;在皮肤组织中TNNI1的相对表达量极显著下调(P<0.01),而TNNI2极显著上调(P<0.01)。【结论】成功克隆了青海湖裸鲤TNNI1、TNNI2基因全长;TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中高表达,表明其与肌肉组织发育密切相关;盐碱胁迫条件下TNNI1、TNNI2基因在腹侧肌肉组织中的表达均显著下调,提示2个基因表达量降低可能是青海湖裸鲤生长缓慢的重要因素。

青海湖裸鲤盐碱耐受过程中的渗透、免疫、代谢相关基因筛选和分析

为探究青海湖裸鲤在盐碱耐受过程中的基因表达变化,对青海湖河口水域以及入湖淡水河——泉吉河中的青海湖裸鲤的鳃、肾脏组织进行转录组测序,筛选青海湖裸鲤耐盐碱过程中发挥作用的免疫、代谢、渗透相关基因。结果显示,使用Trinity对所有样本质控数据(clean data)进行从头组装后共得到541429个非冗余的序列(unigene),N50平均长度达612 bp。经差异表达分析发现,共有832个基因在2个区域中的青海湖裸鲤鳃、肾脏中共表达。经GO功能注释分析,注释到结合(binding)、细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process)、单一生物过程(single-organism process)的DEGs占比较多。KEGG通路分析结果表明,与免疫、代谢、渗透相关的通路得到了富集。根据差异表达基因的GO注释和KEGG信号通路富集分析,实验初步筛选到了青海湖裸鲤渗透相关基因,主要包括钠/钾转运ATP酶(sodium/potassium-transporting,ATPase)、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase)、溶质载体家族(solute carrier family)等;免疫相关基因主要包括白细胞介素(interleukin)、补体(complement)、整合素(integrin)等;代谢相关基因主要有一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)、1,25-二羟基维生素D(3)24-羟化酶(1,25-dihydroxyvitamin D(3)24-hydroxylase)、细胞色素P450(cytochrome P450)等。本实验为青海湖裸鲤的组学研究提供了相关数据,同时也为青海湖裸鲤在盐碱耐受方面的适应性研究奠定了基础。

低浓度铜铅胁迫对1龄青海湖裸鲤组织中抗氧化指标的影响

为明确低浓度重金属离子对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)抗氧化系统的影响,在水温(16±0.3)℃下,将体质量(17.18±2.23)g的1龄青海湖裸鲤放在(500 mm×300 mm×445 mm)水族箱中,用CuSO_(4)·5H_(2)O配制成10 mg/L母液,使Cu^(2+)浓度为0.0004 mg/L、0.002 mg/L、0.01 mg/L;用Pb(NO3)2配制成50 mg/L母液,使Pb^(2+)浓度为0.002 mg/L、0.01 mg/L、0.05 mg/L;Cu^(2+)+Pb^(2+)浓度为(0.0004+0.002)mg/L、(0.002+0.01)mg/L、(0.01+0.05)mg/L下处理6 h、12 h、24 h和48 h后,测定鳃、肝脏和肾脏中总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,T-AOC)、总蛋白(Total Protein,TP)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-PX)活性和浓度变化。结果显示,经过Cu^(2+)和Pb^(2+)胁迫后,青海湖裸鲤鳃、肾脏、肝脏中T-AOC均升高,TP含量总体呈降低趋势;CAT活性在Pb^(2+)和Cu^(2+)+Pb^(2+)复合胁迫下显著降低,SOD活性与MDA含量在不同组织中的表达呈负相关关系。GSH作为GPx的底物,随着时间的延长两者均表现出先诱导升高后降低的趋势。结果表明,单一重金离子低浓度胁迫下青海湖裸鲤抗氧化酶类呈先升高后降低的趋势,Cu-Pb有协同作用,对青海湖裸鲤抗氧化系统的影响比单一离子的毒性效应更大。本研究结果可为青海湖生活水域水质检测提供理论依据,为了解青海湖裸鲤抗氧化应激作用机制奠定基础。

青海湖水系生态需水量分析

为了研究青海湖水系流量变化对生态的影响,遵循河湖自然规律,科学确定青海湖水系3条主要河流生态需水量。文章采用水文学中计算生态基流的4种方法,分别计算出布哈河、沙柳河的全年生态基流为1.58m^(3)/s、0.16m^(3)/s;泉吉站汛期5-9月生态基流量为0.19m^(3)/s。每年5-9月是河道典型鱼类裸鲤洄游产卵重要时期,生态需水完全取决于来水量,计算出生态基流才能保证生态需水量,是保障青海湖流域湿地生态系统稳定和安全的重要措施。

青海湖裸鲤生长特征的研究

对2002年5月—2003年7月采自青海湖的1174尾青海湖裸鲤样本年龄进行了耳石鉴定,并依据年龄推算了生长率。青海湖裸鲤体长与体重的关系为:W=0.000174×L2.4990(♀)、W=0.0000402×L2.7538(♂),雌、雄个体生长差异显著。其体长Von Bertalanffy生长方程为:Lt=551.9301(1-e-0.0711(t+0.3044))(♀),Lt=682.8688(1-e-0.0530(t+0.4240))(♂);体重Von Bertalanffy生长方程为:Wt=1237.3431(1-e-0.0711(t+0.3044))2.4990(♀),Wt=2567.3242×(1-e-0.0530(t+0.4240))2.7538(♂)。其雌、雄生长拐点分别为12.57龄和18.67龄。